[发明专利]一种集靶向、光热于一体的红细胞仿生型纳米粒的制备方法

摘要

本发明涉及制药领域，本发明提供了一种集靶向、光热于一体的红细胞仿生型纳米粒的制备方法。本发明首先提取得到红细胞膜，然后将吲哚菁绿负载在聚乳酸‑羟基乙酸溶液上，将阿霉素包埋于上述体系，通过二次乳化‑溶剂挥发法制得包埋有阿霉素的吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸纳米溶液；之后通过将叶酸壳寡糖与阿霉素‑吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸纳米溶液反应得到阿霉素‑叶酸壳寡糖‑吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸纳米溶液；最后将阿霉素‑叶酸壳寡糖‑吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸挤压进入红细胞膜，即可得到红细胞仿生型纳米粒。

主权项

1.一种集靶向、光热于一体的红细胞仿生型纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取6~8周大小的ICR小鼠数只，使用毛细管进行眼球取血并在血中加入肝素抗凝，得到的全血在1‑5℃，1500‑2500 r/min下离心8‑12 min后去除上层的血清和其他血细胞层，得到的红细胞沉淀用冷处理后的1×PBS洗涤3~5次，备用；2）向步骤1）得到的红细胞沉淀中加入相当于红细胞沉淀55‑65倍体积的冷处理后的0.25×PBS低渗2~3 h，接着在9000‑11000 r/min下离心15~20 min，弃去上层液体，下层淡粉色的沉淀即为红细胞膜，再用0.25×PBS反复洗涤3~5次使得提取的红细胞膜更为纯净，备用；3）将阿霉素溶于水中，配制得到浓度为4‑6wt%的阿霉素溶液；将聚乳酸‑羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配制成浓度为1.5‑2.5wt%的聚乳酸‑羟基乙酸溶液；将聚多巴胺溶于水中，配制成浓度为2.5‑3.5wt%的聚多巴胺溶液；将所有溶液置于1‑5℃的环境中预冷，备用；4)取2~2.5 mg吲哚菁绿加入至3~5 mL聚乳酸‑羟基乙酸溶液中，充分混匀，得到吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸溶液，备用；5）取600~700μL阿霉素溶液加入到3~5 mL 吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸溶液中，超声乳化30~40 s，制得W/O初乳，备用；6）将W/O初乳立即转移到6~10 mL聚多巴胺溶液中，超声30~40 s，制得W/O/W复乳液，备用；7）将W/O/W复乳液逐滴加入到40~50 mL水中，搅拌，陈化3~4 h，待有机溶剂挥发完全后，将得到的纳米粒溶液以800‑1200 r/min离心去除大颗粒，再用0.45μm的微孔滤膜过滤，得阿霉素‑吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸纳米粒溶液，备用；8）称取叶酸220~225 mg，1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐192~197 mg，加入至30~40 mL 的0.1 mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌完全溶解，称取525~530 mg壳寡糖，搅拌下加入叶酸溶液，避光反应3~5 h，备用；9）向步骤8）得到的反应液中加入0.1 mol/L的盐酸溶液，调节其pH值至6.8‑7.2，滴加过程中可见溶液逐渐变浑浊，有沉淀析出；将反应液抽滤2‑4次，去除沉淀，得到滤液，将其置于透析袋中，透析20‑30 h后将其冻干得到黄色海绵状固体，即叶酸壳寡糖，备用；10）称取30~35 mg叶酸壳寡糖和16~18 mg1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺，溶于10~15 mL去离子水中，将其加入到步骤7）得到的阿霉素‑吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸纳米粒溶液中，室温下反应3~5 h后，用0.45 μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素‑叶酸壳寡糖‑吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸纳米混悬液，备用；11）将步骤10）得到的纳米混悬液在1‑5℃下离心，去除上清液，沉淀用去离子水洗涤3~5次，即得到阿霉素‑叶酸壳寡糖‑吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸纳米溶液，备用；12）将步骤2）得到的红细胞膜用1×PBS按照全血体积重悬后水浴超声2~3 min，再利用挤出仪分别通过400 nm和200 nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，得到的细胞膜悬液与步骤11）得到的阿霉素‑叶酸壳寡糖‑吲哚菁绿‑聚乳酸‑羟基乙酸纳米粒溶液以1.8‑2.2:1的体积比混合均匀后，共同通过200 nm的膜混匀反复挤出至少8次，得到红细胞仿生型纳米粒，通过离心去除上层未包裹的多余细胞膜，即可得到纯净的红细胞仿生型纳米粒。