[发明专利]一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法

摘要

一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，涉及分子生物学技术领域。本发明巢式PCR技术，既可检测和鉴定纯菌核酸DNA，也可以检测和鉴定组织液和血液等微量布鲁氏菌核酸DNA；不仅可以鉴定待测标本核酸DNA的布鲁氏菌种型，也可以鉴定其生物型。巢式PCR结果分析可以标准化，试验操作简单，具有普通PCR技术的人员就可以完成。

主权项

1.一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)待检测样品核酸DNA的提取；(2)引物对的设计：应用软件分别设计布鲁氏菌特异性巢式PCR引物，具体的引物序列包括如下：第一次PCR扩增引物：正向引物：SEQ ID NO：1；反向引物：SEQ ID NO：2；第二次PCR扩增引物：正向引物：F2：SEQ ID NO：3；反向引物：R2：SEQ ID NO：4；(3)以步骤(1)提取的核酸DNA为模板，利用SEQ ID NO:1‑2所示引物，通过PCR反应第一次扩增模板核酸DNA，得到第一次PCR产物的核酸DNA；利用SEQ IDNO:3‑4所示引物，通过PCR反应第二次扩增第一次PCR产物的核酸DNA；(4)检测并分析PCR扩增产物；反应结束后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳；所述的1％的琼脂糖凝胶为琼脂糖：凝胶的质量体积比为0.01g/ml；PCR产物经90V电压,1％琼脂糖凝胶电泳1h后，进行凝胶成像分析。若电泳结果被检样品第二次PCR扩增出大小为665‑667bp的目的条带，表明该样品中布鲁氏菌核酸DNA阳性；若电泳结果被检样品第二次PCR扩增未有条带的，表明被检样品不存在布鲁氏菌核酸DNA；(5)PCR产物测序：测序引物为正向引物F2和反向引物R2，双向测序，测通为止；(6)对步骤(5)测序核苷酸序列进行分析确定种型或生物型。