[发明专利]一种可用于软骨损伤修复的具有软骨分化潜能的组织工程脂肪干细胞片层的制备方法

摘要

本发明公开了一种可用于软骨损伤修复的具有软骨分化潜能的组织工程脂肪干细胞片层的制备方法，本发明通过制备特定培养体系，采用细胞片层培养技术获取的ASCs片层是含有细胞外基质的完整片状结构，并具有软骨向分化潜能。由于移植到体内的只有由纯细胞构成的组织，避免了支架等载体的使用以及其所带来的不良反应。而ASCs片层保留了细胞外基质，含有离子通道、生长因子受体和连接蛋白等重要的细胞表面蛋白，细胞间可以更好的保持功能的协调一致，具有传统组织工程技术不可比拟的优点。完整的片层结构有利于细胞在移植部位的存留，大大提高了细胞的利用率和转移细胞的活性。

主权项

1.一种可用于软骨损伤修复的具有软骨分化潜能的组织工程脂肪干细胞片层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)脂肪来源间充质干细胞片层形成培养体系的制备：在DMEM培养基中加入体积浓度为12％的胎牛血清及50μg/ml丝氨酸，得到第一培养基，另制备一份含体积浓度为12％的胎牛血清、20μg/ml抗坏血酸及50μg/ml丝氨酸的第二培养基，使用前均37℃摇床预热；(2)脂肪来源间充质干细胞传代扩增培养：将脂肪来源的原代间充质干细胞用1ml质量体积比为0.25％的胰蛋白酶处理1min，待细胞形态变为球状、细胞间连接断开，用含体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养液3ml终止胰蛋白酶作用，移入离心管，1500rpm离心5min，弃上清，加入含体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养液，按1:3比例传代培养，得到第一代脂肪间充质干细胞；按此方法继续传代培养得到第三代脂肪间充质干细胞；(3)脂肪源性干细胞片层的制备：将步骤(2)得到的第三代脂肪间充质干细胞用1ml质量体积比为0.25％胰蛋白酶消化1min后接种在培养瓶中，接种密度为5×103cells/cm2，在第一培养基中，37℃恒温、体积浓度为5％CO2饱和湿度培养箱内培养至90％融合度(confluent)，更换为第二培养基，连续培养至21天，细胞在底部形成一薄膜状层状结构，将其分离即获取具有软骨分化潜能的组织工程脂肪干细胞片层。