[发明专利]一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法

摘要

本发明涉及一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法。本发明首次通过对半纤维素酶表达基因和酿酒酵母菌株的筛选，成功获得了能够在孢子二酪氨酸层与壳聚糖层之间固定的半纤维素酶，通过对该固定化的半纤维素酶进行检测，发现固定化酶的最适温度提高到75℃、最佳反应pH值降低为3.2，在磷酸盐浓度20mmol/L、Mg²⁺浓度15mmol/L以内时，酶活最高，而这增加了与孢子的萌发最适温度30℃，最适pH值之间的差距，有利于后续固定化酶的稳定。

主权项

1.一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，分别经PCR扩增，获得木聚糖酶xynA基因和信号肽Epr基因；所述PCR扩增的上、下游引物核苷酸序列如下：xynA基因扩增引物上游引物：5'‑CAGGATCCTTCTCAAGGAACGATCAG‑3'；下游引物：5'‑TTGAGCTCACGAGTGCTACCTCAAAG‑3'；Epr基因扩增引物上游引物：5'‑CGGAATTCATGAAAAACATGTCTTG‑3'；下游引物：5'‑TTGGATCCATAACCTCTTTCTCGC‑3'；(2)将步骤(1)得到的半纤维素酶表达基因xynA和信号肽基因Epr分别插入到氨苄抗性质粒pRS424中，经鉴定，制得重组质粒pRS424‑xynA‑Epr；(3)将步骤(2)制得的重组质粒pRS424‑xynA‑Epr转化酿酒酵母OSW2Δ缺陷型菌株，经含氨苄的SD‑Trp缺陷性平板筛选，制得重组酿酒酵母；(4)将重组酿酒酵母接种至SD‑Trp培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h；然后转接至YPAce培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h，制得菌液；(5)离心步骤(4)的菌液收集细胞，清洗，转接至质量百分比浓度1.5％～3％醋酸钾溶液中，28℃～32℃振荡培养24h～48h，使酿酒酵母细胞繁殖子囊孢子，制得孢子菌液；(6)离心步骤(5)的孢子菌液，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2～3次，然后用PBS缓冲液重悬细胞；向细胞悬浮液中加入Lyticase溶壁酶处理1～1.5h后，冰浴超声波破碎；用PBS溶液洗涤破碎细胞2～3次，弃去上清液，分离纯化，制得游离状态的重组酿酒酵母孢子；(7)将步骤(6)制得的游离状态的重组酿酒酵母孢子采用海藻酸钠包埋固定法固定，制得固定化酶颗粒。