[发明专利]一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法及其应用，该方法是由骆驼鲜奶为原料，在温度4℃离心除奶油，采用传统的等电点法沉淀、透析袋、浓缩、冷冻干燥得到总酪蛋白，用胰蛋白酶水解，利用冷冻干燥精制而成抗氧化多肽，再通过超滤膜、凝胶柱子和高效液相分离纯化，得到具有比较强的抗氧化活性的三种骆驼奶抗氧化多肽。其氨基酸一级解构通过高分辨质谱与液质连用色谱技术相结合确定为三个多肽：RLDGQGRPRVWLGR(1665.94Da)，TPDNIDIWLGGIAEPQVKR(2122.13Da)和VAYSDDGENWTEYRDQGAVEGK(2489.09 Da)。该多肽具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含人体易消化和吸收的纯天然蛋白质、18种氨基酸，更适合作为老年人和婴幼儿的理想乳品。

主权项

1.一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：a、将骆驼鲜奶在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，重复2次，除奶油，合并上清液；b、将步骤a上清液用1mol/L的HCL溶液调pH 4.0‑4.5，在温度4℃冰箱放12个小时，使骆驼奶酪蛋白沉淀；c、将步骤b中的沉淀部位在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min后，将沉淀物加入蒸馏水溶解，并用1mol/l的HCl调pH值为7.0，再用磁力搅拌器搅拌完全溶解；d、将步骤c中的溶液用蒸馏水透析48h脱盐，将已脱盐的酪蛋白浓缩，经冷冻干燥机温度‑80℃，压力9.8Pa，冻干24h，所述的透析袋规格是1000Da；e、将步骤d中的酪蛋白通过电泳测抗氧化活性，测蛋白含量，其中电泳分离胶为体积15%的丙烯酰胺；f、将步骤e中得到的酪蛋白，加入蒸馏水使蛋白溶解，调节溶液质量浓度为50g/L，再用浓度为 1 mol/L 的 NaOH 调节溶液 pH 值至8.0，于温度37℃水浴锅中溶解，当溶液无明显颗粒且pH 值无明显变化时，加质量比为1.0%的胰蛋白酶，于恒温水浴锅中用浓度为1 mol/L的 NaOH维持酪蛋白水解液 pH值至 8.0并缓慢搅拌酶解 4 h，并于温度100℃沸水浴中灭酶10 min，自然冷却值室温；g、按体积比1:3将步骤f中得到的水解液加入乙醇，在温度4℃冰箱放12个小时，使大分子蛋白沉淀；h、将步骤g中的溶液在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，除分子量大的蛋白质，用旋转蒸发器浓缩，冻干，得到分子量小的总多肽；i、将步骤h中的总多肽通过3000Da的超滤膜分离，得到分子量小于3000Da的标记为Ⅰ和分子量大于3000Da的标记为Ⅱ；j、将步骤i中得到的分子量小于3000Da的部位Ⅰ通过凝胶柱子分离，得到Ⅰa 和Ⅰb两个部位，比较该两个部位的抗氧化活性，其中凝胶柱使用的缓冲溶液为体积0.1% 的三氟乙酸；k、将步骤j中得到的部位Ⅰb再次通过梯度为25‑70%乙腈0‑40 min，流速为2.5 mL/min的高效液相色谱分离得到Ⅰb‑1，Ⅰb‑2，Ⅰb‑3三个骆驼奶抗氧化多肽。