[发明专利]一种筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用的方法

摘要

一种筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用的方法。所述方法包括：(1)利用基因工程技术将谷氨酸棒杆菌中目的基因克隆到原核表达载体(2)构建蛋白表达菌株并进行目的蛋白的大量表达(3)谷氨酸棒杆菌胞内蛋白的提取(4)对目的蛋白进行纯化并进行His‑Pull Down实验捕获相互作用蛋白(5)对His‑Pull Down后的蛋白进行还原烷基化和胶内酶解，并通过液相色谱质谱联用仪鉴定获取的目的基因互作蛋白。本发明对理解谷氨酸棒杆菌代谢过程中蛋白的相互作用具有重要的意义，进一步基于关键蛋白之间的相互配合关系，相应地进行协调代谢工程改造以及其他方面的运用，因而具有重要的应用价值。

主权项

1.一种筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)目的基因的克隆以及原核表达载体构建根据谷氨酸棒杆菌目的基因的全序列，在目的基因两端引入双酶切位点，利用PCR技术扩增目的基因片段，并进行测序验证；将克隆产物和带His‑Taq的原核表达载体用相同内切酶进行酶切并连接，构建好的原核表达质粒转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，提取质粒并对构建好的质粒进行双酶切验证；(2)构建蛋白表达菌株以及目的蛋白的大量表达将步骤(1)中构建好的载有谷氨酸棒杆菌目的基因的原核表达载体转化到大肠杆菌E.coli BL21或者E.coli Rosetta菌株中，添加诱导剂诱导目的基因表达，通过SDS‑PAGE检测目的蛋白表达情况；对目的蛋白表达条件进行优化以确定最佳条件，使带His‑Taq的可溶性目的蛋白大量表达；(3)谷氨酸棒杆菌胞内蛋白的提取；(4)对目的蛋白进行纯化并利用His‑Pull Down技术捕获互作蛋白用Ni+混合树脂对步骤(2)中所述的带有His‑Taq的可溶性目的蛋白进行纯化，咪唑梯度洗脱，收集蛋白较纯的部分并进行脱盐处理；脱盐后的纯蛋白与步骤(3)提取的谷氨酸棒杆菌胞内蛋白混合孵育后，通过His‑Pull Down实验和SDS‑PAGE电泳捕获与目的蛋白存在相互作用的蛋白；(5)对His‑Pull Down后的蛋白进行还原烷基化和胶内酶解，并通过液相色谱质谱联用仪鉴定获取的与目的蛋白存在相互作用的蛋白对His‑Pull Down后的蛋白进行还原烷基化和胶内酶解，酶解后的肽段用Q‑TOF进行鉴定，通过进行mascot数据库搜索，对互作蛋白进行鉴定。