[发明专利]一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法

摘要

本发明公开了一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，具体包括以下步骤：S1、菌株的分离纯化：得到了单一的曲霉属真菌；S2、发酵培养；S3、菌株次生代谢产物的提取；S4、菌株次生代谢产物的纯化，分离得到了2个抗菌活性化合物A和B；经抑菌活性测试，化合物A和B对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均表现出了良好的抑菌活性；经抗肿瘤活性实验，发现化合物A、B的有效浓度IC50分别为16.6μM、18.2μM表现出抗肿瘤活性，对包括乳腺管癌细胞T‑47D、人乳腺癌细胞MCF‑7、人肝癌细胞SMC‑7721、宫颈癌细胞Hela、人肺癌细胞A549有抑制活性。

主权项

1.一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、菌株的分离纯化取10g印度洋深海沉积物样品于灭菌的试管中，加入100mL无菌海水，振荡混匀得到匀浆，此为10‑1稀释度，按照此方法依次做梯度稀释，得到10‑2、10‑3、10‑4稀释度，依次吸取100μL各个不同稀释度的海水放于固体培养基平板上，用无菌涂布棒将液体均匀涂布在整个平板表面，然后置于20℃培养箱中培养4‑7天；从固体培养基上选取长有单一菌落的真菌菌丝体，采用平板划线法，挑取一环真菌菌丝或孢子，在新平板表面划线5‑6下，然后倒置于20℃培养箱中培养7天，即得到了曲霉属真菌；将纯化好的曲霉属真菌菌株接种于斜面固体培养基保种管内，待曲霉属真菌菌落长成后保存备用；S2、发酵培养将曲霉属真菌菌株从保种管斜面接种到真菌液体培养基平板上，于26℃培养7天作为种子板，从液体平板培养基上用接种针挑取真菌菌落接种到30个含有400ml发酵真菌液体培养基的1000ml锥形瓶中，在26℃、静置无光照条件下发酵培养40天，获得发酵培养液；S3、菌株次生代谢产物的提取将步骤S2得到的发酵培养液用纱布抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三次，得到发酵粗浸液；菌丝体滤渣先用75％乙醇超声提取，所得的提取液浓缩至没有乙醇后，再用等体积的乙酸乙酸萃取三次，得到菌丝体粗浸液，将发酵粗浸液与菌丝体粗浸液合并，即得到了菌株次生代谢产物粗提液；S4、菌株次生代谢产物的纯化往菌株次生代谢产物粗提液中加入硅胶，混合均匀后过Rp‑18反相硅胶柱，使用石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，收集各个洗脱液，减压浓缩、合并，分离得到了2个抗菌活性化合物A和B；所述的抗菌活性化合物A和B的结构式为：