[发明专利]AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用

摘要

本发明公开了一种AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，在不同浓度葡萄糖环境下，设置不同浓度水平的GC干预，通过刺激PKA信号通路，并且在添加刺激剂ISO前后，利用FRET技术实时定量测定PKA的含量，探讨GC怎样通过第二信使PKA信号通路在胰岛β细胞胰岛素分泌中发挥作用，从而进一步补充我们前期关于2型糖尿病的发病机制研究中的欠缺，并为新的糖尿病靶向治疗药物的研发提供实验室方面的依据。

主权项

1.一种AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞培养用含15％胎牛血清、4.5g/L葡萄糖、2％青链霉素、1％L‑谷氨酰胺及1％β‑巯基乙醇的DMEM培养基，在37℃含5％CO2的培养箱中培养，传代至4～15代用于实验；步骤2、分组将MIN6细胞以4×105/孔于6孔培养板中培养，在对数生长期用于实验；一组用于ELISA检测MIN6胞内未添加ISO胰岛素释放量，一组用于ELISA检测MIN6胞内添加ISO胰岛素释放量，细胞分为3部分后分别在无糖、低糖、高糖环境下培养，之后给予不同浓度的Glg：0、500、1000ng/L，干预处理；一组用于FRET技术检测PKA水平；步骤3、方法3.1基于FRET技术在不同浓度葡萄糖和GC干预下实时定量检测PKA；3.2ELISA法检测各组MIN6细胞胰岛素的释放量；3.2.1采集MIN6细胞胰岛素样品；(1)MIN6细胞传代于5个6孔培养板，待其贴壁稳定，状态良好；(2)小心吸出培养基，换入含2％FBS的培养基，继续在37℃环境下培养；(3)培养12h后吸出原有培养基，用Krebs液轻轻冲洗1次，在每孔培养皿加入1ml Krebs液，在37℃环境下孵育2h；(4)吸出原有Krebs液，向各孔培养皿中分别加入处理液1ml，空白对照组直接加入1ml Kerbs，37℃培养箱孵育1h；(5)分别吸取每孔的细胞上清液，移入1.5ml离心管，做好标记后剪取封口膜密封，保存于‑20℃冰箱待测；3.2.2测定MIN6细胞上清中胰岛素(1)准备试剂盒：(2)检测程序：(3)结果计算与判断：①以4000pg/ml、2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、0pg/ml浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标，画出标准曲线图；②根据测得的细胞上清液样品OD值，在标准曲线上计算出相应胰岛素含量，乘上稀释倍数后得出样品内胰岛素含量；步骤4、统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，采用双侧检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。