[发明专利]一种在液体活检中检测端粒酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种在液体活检中检测端粒酶活性的方法，是在筛选癌细胞完毕后，利用亲和素标记的磁珠吸附用生物素标记已经延伸好的产物，从而达到去除液体中蛋白质等其他杂质的影响。本发明与现有技术相比的优点是：本方法在筛选癌细胞完毕后，加入1×TRAP体系、生物素标记的TS引物、dNTP、RII，利用超声破碎细胞后，进行30度水浴30分钟延伸端粒酶，再加入磁珠吸附产物，利用磁力架去除液体，最后加入TRAP PCR反应体系，与磁珠一起进行PCR反应。此方法可以完全去除蛋白质等杂质的影响，并且亲和素标记的磁珠与用生物素标记目标产物有着超高的亲和力，可以保证提取的效率。

主权项

1.一种在液体活检中检测端粒酶活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)尿液样本预处理，并且使用负向筛选法去除免疫细胞和单核细胞后，在筛选后的1.5mlEP管中加入200ul混合液(200ul 1x trap buffer、10ng bio‑TS、1ul dNTPs、0.5U/ul RII)，biotin‑TS的序列为5’‑biotin‑AATCCGTCGAGCAGAGTT‑3’；(2)将1.5mlEP管放入超声破碎仪中，超声破碎细胞；(3)破碎完成后，将1.5mlEP管放入30摄氏度水浴锅中孵育30min，使端粒酶引物发生延伸反应，端粒酶会结合TS引物末端的GTT合成AGGGTTA,然后每经过一次转位合成一个GGTTAG的6个碱基重复序列；(4)1.5mlEP管中加入10ul亲和素标记的磁珠，旋转孵育10min，使得磁珠吸附上一步的延伸产物；(5)使用磁力架吸附磁珠去除管中清液，保留磁珠；(6)在1.5mlEP管中加入50ul TRAP PCR体系，混匀磁珠后，再转移至0.2mlPCR管中；(7)将上述0.2mlPCR管放入PCR仪中进行PCR扩增程序，程序中设置的时间、温度、循环数为：Initial step：90sec 94℃；30cycles：30sec 94℃；30sec 52℃；45sec 72℃；(8)将上一步PCR的反应扩增的端粒酶延伸产物进行western blot印记法验证端粒酶活性；若有端粒酶活性，则会有阶梯状条带。