[发明专利]一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法

摘要

本发明公开了一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法，通过从含有番鸭呼肠孤病毒细胞培养毒提取病毒基因组RNA，通过设计的特定引物，以病毒基因组RNA为模板RT‑PCR扩增MDRV全序列的基因分段，将目的基因分段进行酶切连接成MDRV10个基因片段，并与载体连接，挑取阳性菌落进行测序验证。将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞。在细胞上传代到第15代后，细胞病变开始稳定，获得MDRV重组病毒。

主权项

1.一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法，其特征在于包括下述步骤：（1）提取MDRV 基因组RNA；（2）以步骤（1）的RNA作为模板，用引物进行PCR扩增，得到相应的基因片段或分段的基因；（3）回收和纯化上述PCR产物，将相应分段基因进行酶切连接后，共获得10个基因片段；（4）将上述PCR获得的10个片段与pBD‑initial载体酶切连接加入到JM109感受态细胞中进行转化培养，培养24h提取菌落质粒为模板进行酶切和序列测定鉴定;（5） 将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞;37℃,5%CO2条件下，每天观察细胞病变情况;（6） 在AD293细胞上传代到第15代后，细胞病变开始稳定，在接毒后第4天出现细胞圆缩现象；6天出现细胞拉网，脱落现象；第7天时可以收毒;MDRV‑rMS‑A15(第15代传代毒)重组病毒毒价为10‑5TCID50/0.1mL;为了保持基因组RNA的完整性和纯度，步骤（1）可采用TRIzol试剂提取RNA;步骤（5）提取的质粒可采用质粒提取试剂盒进行提取;PCR引物需满足如下要求：1）S1‑S4片段各设计一对简并引物，上游引物在起始核苷酸的下游区域设计，下游引物在末端核苷酸的上游区域设计，设计的引物能够对MDRV S基因片段全序列进行阳性扩增；2）M1、M2、M3基因各分成2段进行扩增，分别设计两对引物;第一对上游引物在起始核苷酸的下游区域设计；第一对下游引物和第二对上游引物根据基因片段的一个酶切位点（M1为1542‑1547 EcoRI、M2为921‑926 EcoRV、M3为1067‑1072 Bsp1407I）附近区域进行设计；第二对下游引物在末端核苷酸的上游区域设计;通过PCR扩增后将片段进行特异性酶切连接即可得到MDRV M基因片段全序列;3）L1、L2、L3基因各分成3段进行扩增，分别设计三对引物; MDRV L1基因(3959bp)利用1424位NruI酶切位点和 2795为AclI 位点将L1基因分成三段进行扩增，L2基因(3830bp)利用1441位SacI酶切位点和 2719为HpaI 位点将L2基因分成三段进行扩增; L3基因(3907bp)利用1497位EcoRI酶切位点和 2799为NaeI 位点将L3基因分成三段进行扩增; 4）设计PCR引物时按pBD‑initial载体的要求，在上游引物5’端加上GCGCTAT七个碱基。