[发明专利]一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法

摘要

本发明公开了一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，属于鳜鱼分子遗传学领域。所述漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，包括如下步骤：步骤1：基因组DNA的提取；步骤2：引物设计；步骤3：PCR扩增；步骤4：载体拼接、转化、克隆测序；步骤5：序列拼接。本发明以漓江斑鳜为研究对象,设计出14对扩增引物对，经过克隆测序并经过软件拼接，即可获得漓江斑鳜线粒体基因的全长，为漓江斑鳜的种群鉴定、种质资源保护以及养殖选种应用等提供资料和依据，对于深度开展漓江斑鳜资源的保护和利用有着重要的理论意义和应用前景。

主权项

1.一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：基因组DNA的提取采集新鲜的漓江鳜鱼，取尾鳍，立即浸泡在体积分数为95％(v/v)的酒精中固定，于4℃保存；取20mg‑30mg尾鳍，剪碎后,加入到2mL的离心管中，再加入DNA提取缓冲液1mL，再加入蛋白酶K和RNA酶，反复颠倒直至混匀，37℃水浴过夜消化至溶液透明；取出离心管，室温冷却，加入等体积的Tris‑饱和苯酚，上下颠倒，抽提并离心，转移上清液于另一离心管中，重复上述歩骤一次；向转移的上清液中加入等体积的体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，上下颠倒，抽提并离心，重复上述步骤一次；向离心后的上清液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，抽提并离心；向离心后的上清液中加入3倍体积的冷无水乙醇，4℃沉淀30min,离心，弃上清并用乙醇洗涤沉淀；自然干燥后溶于100μL的TE溶液中，得到斑鳜基因组DNA，于‑20℃保存备用；步骤2：引物设计设计14对扩增引物对，14对扩增引物对的序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.28所示；步骤3：PCR扩增以步骤1得到的斑鳜基因组DNA为模板，利用步骤2的扩增引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化，进行PCR产物测序，得到测序序列；步骤4：载体拼接、转化、克隆测序将步骤3中回收的PCR产物，利用SeqMan软件进行连接、转化、克隆、测序，将所得的序列与网上的相近种属的序列用DNAMAN软件进行比对；步骤5：序列拼接利用DNAMAN软件或者手动将相邻的引物扩增的序列进行拼接，最终获得漓江斑鳜线粒体全基因组序列。