[发明专利]针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片的制备方法

摘要

本发明公开了针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法，包括制备条件、制备装置、各种试剂的配制和超薄切片制备方法。所述针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法的整个流程是：首先将植物叶片在戊二醛的浸渍液中渗透，再用锇酸固定，乙醇脱水，Epon 812浸透、包埋，修块，超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，最后进行镜检。本发明解决了在对海南橡胶树叶片用禾本科等类型植物的传统超薄切片制备方法时，出现的在透射电镜制样过程中细胞组织结构不清晰，切片遇水碎裂，包埋剂与组织分离，包埋剂容易受潮等问题，有效缩短了实验操作时间，为橡胶树叶片的超微结构的研究提供了一种有效的技术方法。

主权项

1.针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法，包括制备条件、制备装置、各种试剂的配制和超薄切片制备方法(其中包括用于观察橡胶树叶片组织的超薄切片的染色方法)，其特征在于：所述制备条件和制备装置包括调控实验室温度为22℃～30℃，湿度≤45％；调控摇床温度为22℃～30℃，湿度≤40％，混匀包埋剂的转速为200rpm/min，渗透转速为100rpm/min；所述烘箱温度30℃～60℃，冰箱温度4℃，超薄切片机、真空泵和干燥器放置在室温下备用；所述各种试剂的配制：(1)A液0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液配制：Na2HPO4·2H2O 35.61g加蒸馏水溶解至1000ml；B液0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液配制：Na2HPO4·2H2O 31.21g加蒸馏水溶解至1000ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)100ml：所需缓冲液(PBS)的pH值6.8；A液(ml)24.5ml；B液(ml)25.5ml；蒸馏水(ml)50ml；(3)4％戊二醛、1％锇酸固定液：用0.1mol/LPBS提前两天配制配制，在0℃～4℃条件下保存，其中4％戊二醛和1％锇酸固定液，在每个2ml离心管放入大约1.2ml的固定；(4)饱和醋酸双氧铀染液的配制：取醋酸双氧铀1g，加蒸馏水至100ml。(5)柠檬酸铅染液的配制：硝酸铅1.33g；柠檬酸钠1.76g；蒸馏水30ml；用力震荡30min，使生成乳白色柠檬酸铅悬液(牛奶状)，随后加入0.1mol/L NaOH溶液直至溶液变透明，最终加入蒸馏水定容至50ml。(6)Epon 812包埋剂的配制：按体积计13ml Epon 812、5ml DDSA逐样加入容量瓶中，放置于摇床中充分混匀30min；再加入10ml NMA，放置于调控摇床中充分混匀30min；最后600ul DMP‑30逐样加入容量瓶中，放置于调控摇床中充分混匀30min，待气泡排出，parafilm封口膜封闭，4℃冰箱真空干燥备用。其中：调控摇床温度为22℃～30℃；湿度≤40％；混匀包埋剂的转速为200rpm/min；Epon 812为环氧树脂；DDSA为2‑十二烯基琥珀酸酐；NMA为甲基纳迪克酸酐；DMP‑30为2‑4‑6‑三‑(二甲胺基甲基)苯酚。所述超薄切片制备方法：(1)取材：植物叶片取回后，将叶片切成1mm×2mm的长条样品叶片，取10‑15个修好的样品叶片迅速放入装有1.5ml 4％戊二醛固定液的离心管中，用真空泵抽气约15min，抽去样品叶片组织内部的气体，使样品叶片完全沉入固定液中；(2)前固定和漂洗：抽气后的样品叶片从抽气瓶中取出，迅速放入新鲜的4％戊二醛固定液中，0℃～4℃固定过夜，把经过前固定的样品叶片取出，在4℃条件下，用0.1mol/L的PBS进行漂洗，每次10min，连续漂洗5次，完全洗去样品叶片表面的戊二醛，此上更换试剂操作在冰上，随后放入4℃冰箱中；(3)后固定和漂洗：漂洗后的样品叶片放入1％的锇酸溶液中，parafilm封口膜封闭后，在4℃条件下固定5小时；用0.1mol/L的PBS进行漂洗，每次10min，连续漂洗5次；(4)脱水：将样品叶片用从低浓度的脱水剂逐步到高浓度的脱水剂进行脱水。即用30％无水乙醇，10min；用50％无水乙醇，10min；用70％无水乙醇，10min；用80％无水乙醇，10min；用90％无水乙醇，10min；用100％无水乙醇，10min，2次，用1/2无水乙醇+1/2丙酮，10min；用丙酮10min，2次，此上更换试剂操作在冰上，随后放入4℃冰箱中；(5)浸透：采用梯度Epon 812渗透方法是在调控摇床温度30℃，湿度≤40％，渗透转速为100rpm/min条件下，首先按体积计Epon 812与丙酮的比例为1∶3混合溶液，渗透3h，捞出Epon 812混合液；再以体积计Epon 812与丙酮的比例为1∶1混合溶液，渗透3h，捞出Epon 812混合液；再以体积计Epon 812与丙酮的比例为3∶1混合溶液，渗透3h，捞出Epon812混合液；最后用纯Epon 812，渗透12h～16h；(6)包埋和聚合：先加一滴包埋剂在包埋板孔前端，再用牙签把样品叶片放入包埋板孔前端，将用铅笔写好的标签小心的放在后端的中间，最后慢慢的用纯包埋剂加满包埋板孔，切勿有气泡产生；包埋结束后，将含有包埋好样品叶片的样品包埋块同包埋板放入烘箱，40℃烘12h，60℃烘2d～3d；样品包埋块取出放在干燥器中3d～5d；(7)修块：将样品包埋块经粗修，然后用双面刀片修整成梯形；(8)切片：使用超薄切片机将梯形样品包埋块切成厚度60nm的切片，用镊子夹住铜网，当铜网与水槽面平行时，轻轻蘸取水槽中的样品，置于培养皿中标记，放在烤灯下进行烤干铜网表面水分，待水分烤干后，放入室温干燥器中制干；(9)染色：将制干的铜网放在橡皮塞上面，使用100ul的移液枪吸取吸取醋酸双氧铀液体垂直将液体滴在有支持膜的铜网上，使形成小液珠，进行染色40min，用超纯水冲洗去铜网表面的染色，15min，3次；然后柠檬酸铅染色20min，用超纯水冲洗15min，3次；(10)镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得到结构清晰的图像。