[发明专利]角膜缘干细胞原代培养方法

摘要

本发明涉及一种角膜缘干细胞原代培养方法。其特征在于经庆大霉素溶液处理后的角膜缘组织剪碎后置于组织消化液中消化、过滤，并将滤液离心后获得的角膜缘组织细胞沉淀进行短暂冻存，再将过滤剩余的组织块（即滤渣）用角膜缘干细胞滋养层培养液重悬，接种于用包被液预处理的细胞培养板进行培养，获得角膜缘成纤维细胞，然后用丝裂霉素C溶液处理生长至对数期的角膜缘成纤维细胞，制成角膜缘干细胞滋养层，最后复苏短暂冻存的组织细胞，用角膜缘干细胞原代培养液重悬后，接种在铺有角膜缘干细胞滋养层的细胞培养板中进行原代培养即得。该角膜缘干细胞安全性高、稳定性好，完好地满足了临床治疗的高要求。

主权项

1.一种角膜缘干细胞原代培养方法，其特征在于首先将清洗干净的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中进行消毒和漂洗，然后将角膜缘组织置于组织消化液中，剪切成小块后补加组织消化液进行消化，而后过滤，将滤液离心后获得的角膜缘组织细胞沉淀进行短暂冻存，再将过滤剩余的组织块用角膜缘干细胞滋养层培养液重悬，接种于用包被液预处理的细胞培养板进行培养，获得角膜缘成纤维细胞，然后用丝裂霉素C溶液处理制备角膜缘干细胞滋养层，再复苏短暂冻存的组织细胞，用角膜缘干细胞原代培养液重悬后，接种在铺有角膜缘干细胞滋养层的细胞培养板中进行原代培养，即可获得角膜缘干细胞；上述庆大霉素溶液是含有100 U/ml庆大霉素的DMEM/F12培养基；上述组织消化液是2.4~4.8 U/ml的Dispase II酶溶解于含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养基；上述角膜缘干细胞滋养层培养液是含有10%胎牛血清和10~20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基；上述包被液的配方是含有10~30 μg/ml纤连蛋白、5~20 μg/ml层粘连蛋白5和1~2 mg/ml明胶的DMEM/F12培养基；上述丝裂霉素C溶液是含有10 μg/ml丝裂霉素C的DMEM/F12培养基；上述角膜缘干细胞原代培养液的配方是含有5~10%胎牛血清、10~40 ng/ml表皮生长因子、10~20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1~10 μg/ml胰岛素、1~10 μg/ml转铁蛋白、1~5 ng/ml亚硒酸钠、0.2~1 μg/ml氢化可的松、5~20 ng/ml白血病抑制因子、5~10 ng/ml白介素‑6、5~20 μg/ml纤连蛋白、5~10 μg/ml层粘连蛋白5和5~10%处于生长对数期的角膜缘干细胞滋养层培养上清液的DMEM/F12培养基。