[发明专利]一种绒毛膜间充质干细胞冻存液

摘要

本发明涉及一种绒毛膜间充质干细胞冻存液及其制备方法，其原料按体积百分比包括：二甲基亚砜10％‑20％，人血白蛋白20％‑70％，绒毛膜间充质干细胞条件培养基10％‑60％。本发明的冻存液使绒毛膜间充质干细胞冻存效果良好，可以保持绒毛膜间充质干细胞90％以上活率和95％回收率一年以上，大大提高了绒毛膜间充质干细胞的复苏后的增殖速率；同时检测细胞表型时，复苏后的干细胞高效表达CD90、CD73、CD105，符合绒毛膜间充质干细胞表型特征。

主权项

1.一种绒毛膜间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采集胎盘样本，在24小时内对胎盘样本进行处理，将胎盘样本上绒毛膜组织剪切并进行消化，消化液为0.25％胰酶‑EDTA，消化液与绒毛膜体积比为1:4‑1:1，消化时间30‑60分钟，消化后用100微米滤网进行过滤，将消化、过滤后的细胞接种至T75培养瓶中培养；(2)每隔3‑4天，对T75培养瓶中的细胞用无血清完全培养基进行换液，待细胞融合率至75‑90％时进行传代，弃去培养液上清，用生理盐水清洗细胞2遍，再向细胞中加入3ml的0.25％胰酶‑EDTA，消化3分钟，用5倍消化液体积的完全培养基终止消化，1500rpm条件下离心5分钟，收集细胞接种于含完全培养基的培养瓶中，接种密度为3000‑8000/cm2；(3)传代至P2‑P5代后，细胞连续培养24‑96小时后，收集培养上清液，将上清液转移入无菌离心管中，在1000‑1500rpm条件下，离心5‑10分钟，去除沉淀，或者将上清液通过70微米滤网过滤，获得滤液，获得绒毛膜间充质干细胞条件培养基；(4)将二甲基亚砜，人血白蛋白，所述绒毛膜间充质干细胞条件培养基分别按照体积百分比10％‑20％、20％‑70％、10％‑60％混匀，获得绒毛膜间充质干细胞冻存液。