[发明专利]一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法

摘要

本发明公开了一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，包括以下步骤：(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，进行两步消化后使用移液器吹成单个细胞再重悬过滤；(2)细胞纯化：将悬液接种在培养皿中培养，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，进行两次培养后收集贴壁细胞得到纯化后的样细胞；(3)细胞固定：使用组织固定液将细胞固定，以5μl/滴的量滴在载玻片涂抹开并烘干；(4)孵育：用免疫组化笔将样本圈住，对细胞质或细胞核中的基因进行定位透膜，分别用一抗二抗孵育清洗；(5)染色：在免疫组化圈内滴加染色剂，盖上盖玻片用指甲油封片保存。本发明提供了提供一种易于操作，染色效果好的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法。

主权项

1.一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，加入依次一步消化液进行一步消化，消化完成后重悬滤去上层清液，再加入二步消化液进行消化，再次重悬滤去上层清液，得到底层重悬液的精细小管内部精原干细胞释放出来，使用移液器吹成单个细胞，使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管离心后，再使用培养液进行重悬后使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液；(2)细胞纯化：将步骤(1)中获得的水牛睾丸单细胞悬液接种在铺有明胶的培养皿中，使用培养液过夜培养，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，将其转移至铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中，进行一次培养收集上清细胞，转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中进行二次培养后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的水牛精原干细胞样细胞；(3)细胞固定：将步骤(2)中的到的水牛精原干细胞样细胞使用组织固定液固定，将固定好的精原干细胞样细胞以5μl/滴的量滴在洁净的载玻片上并涂抹开，置于烘箱中烘干；(4)孵育：在步骤(3)中做好的载玻片中用免疫组化笔将样本圈住，使用TritonX‑100‑PBS透膜对细胞质或细胞核中的基因进行定位通透，使用马血清封闭0.5～2h后，先用一抗孵育，清洗，在进行二抗孵育和清洗，得到孵育完成的样本；(5)染色：在免疫组化圈内滴加含有抗荧光淬灭剂的染色剂，盖上盖玻片并用指甲油封片保存。