[发明专利]一种利用LC-MS/MS检测食品中甲壳动物原肌球蛋白的方法

摘要

一种利用LC‑MS/MS检测食品中甲壳类原肌球蛋白的方法，从36种甲壳动物中获得原肌球蛋白氨基酸序列，进行序列对比得到其高度保守区域，模拟酶解过程得到一系列肽段，选择不含半胱氨酸和蛋氨酸的肽段，进行高分辨质谱检测，选择响应高、重复性好的肽段作为原肌球蛋白的定量肽段，制备高纯度标准品，以定量肽段标准品的浓度值为横坐标，以其定量子离子峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，待测样品经酶解净化后待LCMS/MS检测，进而计算得到样品中原肌球蛋白浓度。本发明从具有代表性且性质稳定的特征肽段中选择酶解较稳定且酶解效率高的作为定量肽段，消除蛋白结构变化、蛋白修饰及基质效应等对检测的影响，具有准确、精密和灵敏等优点。

主权项

1.一种利用LC‑MS/MS检测甲壳动物原肌球蛋白的方法，包括如下步骤：步骤（1）从UniProt蛋白库搜索到甲壳动物原肌球蛋白氨基酸序列；该原肌球蛋白氨基酸序列长度为284，涵盖了19种虾、3种虾蛄、2种虾鳌、3种龙虾和10种蟹在内的36种甲壳动物；步骤（2）将该氨基酸序列导入DNAMAN 软件，进行氨基酸序列对比，得到其高度保守区域80‑215，同源性高达98.52％；步骤（3）将原肌球蛋白高度保守区域导入Skyline 软件，模拟酶解过程，模拟酶解结束后得到一系列肽段；步骤（4）选择不含有半胱氨酸（C）和蛋氨酸（M）、且长度在8‑18个氨基酸之间的肽段，得到此类肽段92IQLLEEDLER101、113LAEASQAADESER125、153FLAEEADR160、190IVELEEELR198、206SLEVSEEK213共五个；步骤（5）将上述五个肽段进行高分辨质谱检测，选择响应高、重复性好的IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR三个肽段作为甲壳类动物原肌球蛋白的特征肽段；步骤（6）将特征肽段进行化学合成，制备纯度高于95%的标准品；步骤（7）特征肽段的定量子离子峰面积作为纵坐标分别绘制标准曲线，得到三个方程；其中，液相色谱条件：色谱柱：EC‑C18分析柱（100 mm×3 mm，2.7 μm）；流动相A:0.1%甲酸水；流动相B：0.1%甲酸乙腈；使用以下梯度：0 min，10%B；4 min，25%B；10 min，30%B；10.1 min，100%B；12 min，100%B；14 min，10%B；17 min，10%B；流速：0.3 mL·min‑1；柱温：35 °C；进样体积：10 mL；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；气体：氮气；干燥气温度：300 °C，干燥气体流量12.0 L/ min；雾化器气体压力：40 psi，电喷雾毛细管电压：3500 V；步骤（8）在上述三十六中甲壳类动物中选择其中一种，将该动物的肌肉组织与蛋白提取液按照1：10比例混合匀浆，水平震荡30 min，离心后取上清；100 ℃加热5 min，离心取上清液，得到蛋白提取液，通过BCA方法测得其蛋白质浓度；取蛋白提取液100 μL稀释10倍进行酶解，按照酶与蛋白的质量比1：30，1：15，1：10，2：15，1：6，1：5和1：3添加酶进行酶用量的优化，酶解时间均为16 h，加入1%甲酸终止酶解，用固相萃取柱对酶解液进行净化，待LC‑MS/MS检测，通过酶解结果可知，IVELEEELR在不同酶浓度条件下酶解性质稳定用作定量肽段， IQLLEEDLER、LAEASQAADESER酶解性质不稳定用作为定性肽段；因此最终选择酶与蛋白的质量比为1：15作为最优的酶添加量；在酶与蛋白的质量比为1：15的基础上对1 h、3h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h和16 h八个酶解时间进行优化，酶解时间达到13 h后三个特征肽段的酶解水平趋于稳定，因此选择酶解时间为13 h；（9）以步骤（8）所选甲壳类动物的肌肉制备肌原纤维蛋白丙酮粉末，并重新溶解在50 mmol/L Tris‑HCl缓冲液中；经过50％硫酸铵饱条件下的盐析提取和2次pH4.5等电点沉淀后，从肌原纤维蛋白溶液中获得原肌球蛋白沉淀；将沉淀溶于水溶液中，用透析袋进行透析除盐，透析液为水，间隔6h换一次透析液，重复3次；将透析过的原肌球蛋白溶液冷冻干燥后，配置成1mg/mL水溶液，进行酶解，酶解方法与步骤（8）一致；步骤（10）以定量肽段IVELEEELR的标准曲线作为样品检测的定量标准曲线；步骤（11）提取待测样品总蛋白，样品总蛋白经过酶解后净化，得到净化酶解液，酶解采用步骤（8）得到的酶解优化条件，将得到的净化酶解液进行LC‑MS/MS检测，得到食物样品中定量肽段子离子峰面积，再根据标准曲线求得样品中定量肽段浓度，进而得到样品原肌球蛋白浓度。