[发明专利]紫杉醇的生产方法

摘要

本发明提供一种紫杉醇的生产方法，包括以下步骤：1)建立稳定的红豆杉形成层干细胞培养体系；2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，接种红豆杉细胞，人工光照条件下进行通气培养，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养；3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，离心，获得沉淀物，往所述沉淀物中添加去离子水，超声波破碎，离心获得上清液，往所述上清液中添加乙酸乙酯，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；4)对浸膏I进行纯化；5)利用四氢呋喃‑丙酮混合液进行重结晶。本发明具有提取工艺简单、纯度高等特点。

主权项

1.一种紫杉醇的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10‑30分钟后，置于75％酒精中处理10‑30秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3～5次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7‑8天继代一次，经2‑3个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0～12.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种率不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为24℃‑26℃，人工光照条件下进行通气培养6‑8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤3‑5次，离心，获得沉淀物，往所述沉淀物中添加去离子水，超声波破碎5‑10min，离心获得上清液，往所述上清液中添加乙酸乙酯，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取2‑3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10‑11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43‑46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浸膏II；5)往所述浸膏II添加四氢呋喃‑丙酮混合液加热溶解，冷切至室温，自然结晶，晶体再次溶解到四氢呋喃‑丙酮混合液进行重结晶2‑3次，获得高纯度的紫杉醇。