[发明专利]一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法

摘要

本发明涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的bai2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养50h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，还可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。干扰bai2基因的表达，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示心脏形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上心脏疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

主权项

1.一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）分别设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼bai2基因的基因组DNA序列，在网站SMART（http://smart.embl‑heidelberg.de/）上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计bai2基因的打靶位点；两对特异性靶位点PCR 引物如下：F1（靶位点a正向引物）：TGTAATACGACTCACTATAGGtacggctccttctcgctcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF3（靶位点b正向引物）：TGTAATACGACTCACTATAGgggaccatacagagttccaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR（共用的反向引物）：AAGCACCGACTCGGTGCCACTPCR 检测引物:F(5’‑tgtctgtgctgtcatccctttt‑3’)R(5’‑aagcattcctcaaaccaccggc‑3’)2）构建gRNA表达载体以及特异性gRNA体外合成首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上；特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒；酶切反应总体积为20 μL，体系如下：p42250载体         2 μL10× Buffer        2μLBsa I限制性内切酶  1.5 μLddH2O              14.5μL总体积             20μL混匀后于37 ℃水浴，酶切4 h以上；以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；正向特异性靶位点引物F1或F3：T7启动子20bp+ 靶序列20bp + sgRNA上游骨架，反向引物R：20 bp sgRNA下游骨架，PCR反应体系如下：ddH2O                  18μL2× Buffer             25μLdNTPs（10 mM）           1μLPrimer F1（或F3，10 uM）  2μLPrimer R（10 uM）        2 μL模板（p42250载体）       1 μLEx‑Taq DNA聚合酶       1 μL总体积                 50 μL震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，待反应结束后，取1μL样品点样于2.0 %琼脂糖凝胶，进行电泳检测，凝胶成像系统拍摄结果；检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20 μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA；转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase‑Free产品，具体操作如下：体外转录反应体系：模板DNA             12 μL10×Buffer          2 μLrATP（10 mM）         1 μLrUTP（10 mM）         1 μLrCTP（10 mM）         1 μLrGTP（10 mM）         1 μLT7 RNA聚合酶        2 μL总体积              20 μL将反应物全部加入1.5 mL RNase‑Free 的EP管中，混匀之后，于37 ℃水浴2.5 h；然后向转录体系中加入1 μL DNA酶，放置于37 ℃水浴锅中反应30 min，用以消化DNA模板；再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率；特异性gRNA的纯化用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于‑20 ℃；吸取纯化后的gRNA溶液1 μL进行浓度检测3）斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30 min 之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9 蛋白和gRNA配成混合液（其中Cas9蛋白购于thermo fisher公司），Cas9 蛋白的浓度为 5μg/μL，gRNA 的终浓度在30‑40ng/μL之间，注射约1.8 nL Cas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于E3水中，28 ℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；显微注射体系如下：Cas9 蛋白        5μg/μLgRNA             30‑40ng/μLNuclease‑Free WaterTotal            3μL；4）Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其bai2基因是否存在突变，可以提前确认此次设计的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；a、提取斑马鱼基因组斑马鱼胚胎受精50小时后（50 hpf），分别收集野生型（做对照）和注射后胚胎于1.5 mL Ep管中，每管5颗胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：向装有胚胎的Ep管中加入100 μL细胞裂解液，1 μL蛋白酶K，放置于55 ℃恒温箱中裂解过夜；裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中，充分颠倒混匀，于4 ℃条件下，12000rpm离心10 min，倒掉上清液；加入75 %乙醇200 μL，于4 ℃条件下，12000rpm离心5 min，弃上清液，室温风干8‑10min；加入10μL去离子水，充分吹打混匀，即得斑马鱼基因组DNA；b、PCR扩增目的序列提取基因组DNA后，根据CRISPR靶位点上下游约100‑250 bp的基因组区域，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；PCR反应体系如下：2×Es Taq MasterMix          10 μLPrimer F (10 μM)             0.6 μLPrimer R (10 μM)             0.6 μL模板(基因组DNA)              1 μLddH2O                        7.8 μL总体积                       20 μL震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；c、用1.8 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，d、送部分PCR产物进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；e、注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；5）获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28 ℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取5个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出571 bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带；如果此突变可以遗传到F1代，则PCR扩增会出现小于571 bp的小带；如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至 1‑2个月，再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体。