[发明专利]一种乳酸乳球菌MG1363的构建及其在治疗产妇乳头皲裂中的应用

摘要

一种乳酸乳球菌MG1363的构建及其在治疗产妇乳头皲裂中的应用。首先通过化学合成人源及鼠源趋化因子CXCL12，又称基质细胞衍生因子‑1(SDF‑1)，属于CXC类趋化因子家族的小分子蛋白。再加入乳酸乳球菌特有的分泌表达穿膜肽SPusp45,构建成pMG36e‑CXCL12重组质粒，之后电转进入乳酸乳球菌MG1363，实现趋化因子CXCL12的分泌表达。通过外用乳头创面涂抹方式进行给药，一方面菌液直接分泌表达趋化因子CXCL12可实现乳头创面快速修复；另一方面，婴儿或新生儿通过直接吸吮的哺乳方式可获得益生菌补给，帮助婴儿或新生儿平衡肠道菌群提高自身免疫力。

主权项

1.一种分泌表达趋化因子CXCL12的乳酸乳球菌MG1363的构建，其特征在于,由以下步骤组成：(1)pMG36e‑CXCL12重组质粒构建:PstI‑SPusp45‑CXCL12‑HindIII全序列化学合成获得pUC57‑CXCL12重组质粒；(2)构建pMG36e‑CXCL12重组质粒：A：采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57‑CXCL12质粒；B：酶切：pMG36e，pUC57‑CXCL12酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；C：配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电泳45min；在276bp和3600bp左右切胶回收；D：酶连：酶连体系如下，总体系10μL，Fragment:Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；E：转化由以下步骤组成:a:从‑80℃冰箱中取200μL MC1061感受态细胞悬液，冰上解冻；b:加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；c:42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3‑5min；d:向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态。离心4000rpm，1min。弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；e:将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含300ng/μL红霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16‑24h，挑取单克隆；F:测序；G:测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pMG36e‑CXCL12，保存备用，步骤同上。