[发明专利]一种spo11基因的敲除方法

摘要

本发明公开了一种spo11基因的敲除方法，利用CRISPR/Cas9技术对减数分裂相关基因spo11进行敲除。通过本发明的方法，通过敲除spo11基因，继而可以特异性获得雄性不育个体，可以通过建立敲除家系。

主权项

1.一种spo11基因的敲除方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术对减数分裂相关基因spo11进行敲除，具体操作如下：（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ENSDART00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为：TGGAAACGGTCGACAGATGCCAGG；（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性；（3）gRNA的获得：以gRNA‑plasmid为模板，以gRNA‑F/gRNA‑R为引物，gRNA‑F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA‑R：AGCACCGACTCGGTGCCACT,利用KOD Plus（TAKARA）高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18‑T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用MEGAscript® T7 Transcription Kit (InvitrogenTM)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：10x Reaction Buffer 2ｕl；Plasmid DNA 4ｕl (约1ｕg）；T7 Enzyme 2ｕl；10mmol/L NTP 1ｕl；DEPC water 11ｕl；以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；（4）体外转录获得Cas9 mRNA ：Cas9质粒来自AddgeneTM(#63154),使用MAXIscript®T7/T3 Transcription Kit (InvitrogenTM),合成Cas9 mRNA，体系及反应条件同步骤3；（5）Cas9 mRNA和gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：Cas9 mRNA 300 ng/ｕl；gRNA 30ng/ｕl；Phenol‑red 0.2ｕl；DEPC Water up to 2ｕl；将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率；（6）spo11 F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，以F‑spo11/R‑spo11为引物，F‑spo11：5’‑ATGGCTTACCAGTTTACTG‑3’; R‑spo11: 5’‑CGTAGCTCTTTCAGTAACTC‑3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18‑T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得10条F1代个体突变效率和突变类型。