[发明专利]一种用于活化干细胞的方法和装置

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种用于活化干细胞的方法和装置，取健康BALB/cl和C57BL/6小鼠，雌雄不限，6～8周龄；小鼠脾脏干细胞的培养和分化：小鼠脾脏干细胞的培养条件；培养皿用gelatin 0.1％包被,加小鼠脾脏成纤维细胞为滋养层,克隆形成能力和胚样小体形成能力检测；Sp‑MSCs的分离培养；分化能力鉴定；小鼠T淋巴细胞分离；细胞因子处理,抗体阵列以及Westernblot；淋巴细胞转化实验和混合淋巴细胞反应：统计学。本发明提出了通过分析细胞信号传导网络来表征细胞状态的一个新概念。通过同时检测细胞内的多个信号网络节点,就能够揭示细胞内各种激酶的活力动态。

主权项

1.一种用于活化干细胞的方法，其特征在于，所述用于活化干细胞的方法包括：1)取健康BALB/cl和C57BL/6小鼠，雌雄不限，6～8周龄；2)小鼠脾脏干细胞的培养和分化：小鼠脾脏干细胞的培养条件:培养皿用gelatin0.1％包被,加小鼠脾脏成纤维细胞为滋养层,1000U/mLLIF,15％胎牛血清,0.1mmol/L非必需氨基酸,2mmol/L谷氨酰胺,0.1mmol/Lβ‑巯基乙醇,knock‑outDulbecco’smodifiedEagle’smedium；3)克隆形成能力和胚样小体形成能力检测:1000个细胞在六孔板的孔内培养5～6天,培养条件同小鼠脾脏干细胞的培养,但是不加脾脏成纤维细胞；细胞用4％PFA固定后,用NBT/BCIP染色碱性磷酸酶,计数阳性克隆的数量；胚样小体的检测中，1000个细胞培养在半固体培养基methylcellulose‑basedsemi‑solidmedium中,5～6天后计数胚样小体；重复3次；4)Sp‑MSCs的分离培养：无菌条件下以注射器柄将脾脏碾碎，以0.1％的II型胶原酶液消化获得的基质组织1h，将消化后的基质组织种入Sp‑MSCs培养体系内，3d首次换液；待Sp‑MSCs爬满培养瓶后，以胰酶消化传代，取第3～6代细胞；5)Sp‑MSCs的分化能力鉴定：取第4代Sp‑MSCs，种于24孔培养板中，加入成骨诱导体系:含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，地塞米松10－7mol/L，β磷酸甘油10mmol/L和维生素C磷酸盐50μmol/L；诱导7d进行碱性磷酸酶染色；取第4代Sp‑MSCs，种于3×104/cm2的24孔培养板中，加入成脂肪诱导体系:含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，IBMX0.5μmol/L，地塞米松10－6mol/L和胰岛素10ng/mL；诱导7d后进行油红染色；6)小鼠T淋巴细胞分离：无菌条件下以注射器柄碾磨鼠脾脏，将获得的粗制细胞悬液过200目钢筛去除团块，再以Ficoll分离液以800g离心20min，得到混合的脾脏免疫细胞；以PBS洗净，将脾脏免疫细胞过填充有尼龙毛的50mL注射器，收获的不贴附的细胞即为T淋巴细胞；7)流式细胞分析FACS：Oct4‑GFP细胞经消化,成单细胞悬液在PBS中,用FACSScan通过cellquestsoftware分析；通过正面和侧面的光散射特征确认活细胞,LW系为阴性对照,读取GFP的荧光强度；8)、细胞因子处理,抗体阵列以及Westernblot；9)、淋巴细胞转化实验和混合淋巴细胞反应：进行分析的T淋巴细胞需预先进行CFSE标记；T淋巴细胞的密度调整为1×106ml，加入ConA 2μg/mL，48h后拍照；10)、统计学方法：结果以数据分析装置集成的软件分析，数据以均值方差表示，P值小于0.05为统计学意义，P＜0.05，P＜0.01。