[发明专利]利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种利用DDA‑DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，包括以下步骤：1)、DDA采集模式建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库；2)、DIA模式采集待试样品信息：取小蕾期、中蕾期、大蕾期红颊草莓柱头，分别制备成肽段溶液，再进行DIA模式采集定量数据；3)、筛选差异蛋白：将步骤1)得到的信息库列表和步骤2)得到的DIA原始文件导入分析软件Spectronaut Pulsar进行匹配定量、T检验分析，以中蕾期样品为总对照筛选出p0.05且小蕾期样品、大蕾期样品分别相较中蕾期样品表达倍数≥1.5或者≤2/3的差异蛋白。采用该方法能实现对红颊草莓柱头差异蛋白的定量筛选。

主权项

1.利用DDA‑DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，其特征是依次包括以下步骤：1)、DDA采集模式建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库：将小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱头按照1:1:1的数量混合后作为样品，从而建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库；2)、DIA模式采集待试样品信息：①、质谱上机样品准备和分组取小蕾期、中蕾期、大蕾期红颊草莓柱头，分别液氮研磨，从而分别获得相应的样品；每个样品经处理后所得的肽段干粉用体积浓度为0.1％甲酸水溶液进行溶解，从而得到浓度为1μg/μL的肽段溶液；②、DIA模式采集定量数据上述每个样品均分别进行如下操作：取20μL肽段溶液到进样管，再加入1μL 1×iRT标准肽段溶液混匀，分别进行反向C18液相分离串联Q Exactive质谱DIA模式采集，从而获得相应的DIA原始数据文件；C18液相流动相组分：C18 Buffer A:0.1％甲酸水溶液，C18 Buffer B:0.1％甲酸乙腈溶液；分离梯度：0～3min，4～7％C18 Buffer B；3～103min，7～18％C18 Buffer B；103～113min，18～35％C18 Buffer B；113～117min，35～75％C18 Buffer B；117～120min，75％C18 Buffer B；上述每个时间段的流动相余量为C18 Buffer A；每个时间段内，C18 Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1ml/min；DIA模式参数设置为：扫描时间120min，离子模式正离子，一级质谱分辨率70000@m/z 200，最大注入时间50ms，扫描范围350‑1300m/z；二级扫描分辨率17500@m/z 200；碰撞能量27％，分设32个隔离窗口，具体为350‑381m/z,381‑398m/z,398‑415m/z,415‑432m/z,432‑444,444‑456m/z,456‑468m/z,468‑480m/z,480‑492m/z,492‑504m/z,504‑516m/z,516‑528m/z,528‑540m/z,540‑552m/z,552‑564m/z,564‑576m/z,576‑592m/z,592‑608m/z,608‑624m/z,624‑640m/z,624‑640m/z,640‑656m/z,656‑672m/z,672‑688m/z,688‑712m/z,712‑736m/z,736‑766m/z,766‑806m/z,806‑856m/z,856‑926m/z,926‑1300m/z；3)筛选差异蛋白：将步骤1)得到的信息库列表和步骤2)得到的DIA原始文件导入分析软件Spectronaut Pulsar进行匹配定量、T检验分析，以中蕾期样品为总对照筛选出p<0.05且小蕾期样品、大蕾期样品分别相较中蕾期样品表达倍数≥1.5或者≤2/3的差异蛋白。