[发明专利]单链测序文库的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了提供了高通量测序文库的构建方法及其应用。其中，构建高通量测序文库的方法包括：将基因组DNA片段化和末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，连接接头并扩增后，将所述DNA文库用外切酶进行消化得到单链DNA文库；利用特异性探针对连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段。本发明改进DNA杂交流程，将常规双链DNA模板通过酶切消化成单链，再采用环状寡核苷酸的完全封闭引入的接头和标签序列，用探针(RNA或DNA)对单链DNA模板进行捕获，可以降低杂交捕获的时间，提高探针捕获目的DNA序列的效率，降低GC区域捕获的偏好性。

主权项

1.一种构建高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：将基因组DNA片段化，以便获得DNA片段；将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物；将所述连接产物通过一条带有5端磷酸化的引物和另一条5端不带有磷酸化的引物进行PCR扩增，得到DNA文库；将所述DNA产物用外切酶进行消化得到单链DNA文库；任选地，所述外切酶为lambda核酸外切酶；任选地，将所述DNA文库与封闭寡核苷酸，特异性探针混合以进行杂交捕获，所述封闭寡核苷酸会形成环状封闭DNA文库两端引入的接头和/或标签序列，所述特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；其中，所述环状封闭寡核苷酸是对接头和/或标签序列设计的，所述封闭寡核苷酸两段分别与DNA文库两端的接头和/或标签序列互补配对，连接形成闭环，实现环状封闭；任选地，所述杂交捕获为6～8h；任选地，所述杂交捕获后用带有链霉亲和素的磁珠吸附并洗涤；将获得的所述目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；任选地，所述PCR扩增扩增10‑12个循环；以及分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成所述高通量测序文库，任选地，进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤，优选所述样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种，更优选所述哺乳动物为人和小鼠的至少一种，优选所述基因组DNA为人类全血基因组DNA，更优选所述基因组DNA为外周血单核细胞基因组DNA，优选地，所述基因组DNA的量为2μg，任选地，利用covaris‑S2打断仪将基因组DNA片段化，任选地，所述DNA片段的长度为约150‑300bp，优选200‑250bp，任选地，在将所述DNA片段进行末端修复前，进一步包括纯化DNA片段的步骤，任选地，将所述DNA片段进行末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，其中，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性，任选地，将所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A是利用Klenow(3’‑5’exo‑)进行的，任选地，所述接头中包含标签序列，任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的，任选地，在获得连接产物后，进一步包括对连接产物进行纯化的步骤，任选地，所述特异性探针是采用eArray系统设计的，任选地，所述探针的长度为120mer，任选地，采用1μg的连接产物进行所述杂交捕获，任选地，使用热启动DNA聚合酶进行所述PCR扩增，任选地，分离纯化所述扩增产物是通过选自磁珠纯化、纯化柱纯化和2％的琼脂糖凝胶电泳的至少一种进行的，优选通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行，任选地，所述高通量测序文库的文库片段长度为300～450bp。