[发明专利]单细胞线粒体拷贝数检测方法

摘要

单细胞线粒体拷贝数检测方法，包括以下步骤：（1）、引物和探针设计：针对线粒体DNA11778位点G>A突变设计一对产物长度约1000bp的引物（序列1和序列2）用于标准品制作，一对Taqman探针（序列3‑6）用于检测；（2）、单细胞裂解和检测：利用配制的裂解液处理样本后直接行Taqman定量检测；（3）、数据分析：Ct值标准曲线法计算线粒体拷贝数；本发明总体操作步骤简单，对操作人员的技术水平要求低，而且数据分析方法简单，只要具有基本的Excel知识即可分析，解决了临床上对于单细胞线粒体拷贝数检测的目的，适用于临床推广。

主权项

1.单细胞线粒体拷贝数检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、探针和引物设计：针对线粒体DNA11778位点设计相应的引物，首先在线粒体DNA11778位点上下游序列设计一对产物约为1000bp的引物作为用于标准品制作的引物（序列1和序列2）；针对线粒体DNA11778位点G>A突变，设计一对Taqman探针，包括不带突变VIC探针（序列3）、携带突变的FAM探针（序列4）以及探针所需的引物（序列5和序列6），引物序列如下：序列1：CAACAACCTATTTAGCTGTTCCCC；序列2：GTAAGGCGAGGTTAGCGAGG；序列3：CACAGTCGCATCATA（荧光基团为VIC，猝灭基团为MGB的Taqman探针）；序列4：ACTCACAGTCACATCA（荧光基团为FAM，猝灭基团为MGB的Taqman探针）；序列5：GCTTACATCCTCATTACTATTCTGCCTA；序列6：GAGTAGAGTTTGAAGTCCTTGAGAGAG；（2）、双标准品建立：正常人的血液标本和患者的血液标本提取DNA后测定浓度，建立浓度25‑50ng/mL的模板DNA，利用引物序列1和引物序列2进行普通PCR扩增，反应体系如下：2´Hot Start Master Mix 25mL，引物序列1（10mM）1mL，引物序列2（10mM）1mL，模板DNA (总量50‑100ng) 2mL，水21mL，总体积50mL；反应在ABThermalCycler上进行，反应程序如下：95°C 2min→95°C30sec→63°C30sec→72°C1min，以上反应程序反复进行30个循环，接着为72°C 10min，最后4°C保存；PCR产物跑胶检测条带均一性，制作1.5%琼脂糖凝胶，以1：1000的比例加入GelRed，跑胶后可见971bp单一条带，割胶回收，提取DNA，根据DNA浓度和片段长度代入公式计算拷贝数：拷贝数(拷贝/ uL)= [DNA浓度ng/mL] × 6.0221409×1023                     [片段长度bp] × 650 × 109
通过加水稀释DNA，分别建立正常和患者109拷贝/ mL至 102拷贝/mL共16个标准品；（3）、Taqman双标准曲线建立:准备上述的16个样本，以及不同比例混合的患者和正常人的DNA，采用Taqman方法进行标准曲线的建立和比例校准；Taqman反应体系如下：2´Taqman Universal Master Mix (With UGI) 5mL，引物序列3（10mM）0.2mL，引物序列4（10mM）0.2mL，标准品DNA 1mL，水3.2mL，总体系10mL，反应在LifeQuantStudio 12K Flex荧光定量PCR系统上进行，反应程序如下：首先是扩增过程：95°C2min→95°C 30sec→63°C 30sec→72°C 1min，以上反应程序进行30个循环；然后72°C 10min，接着进行熔解曲线过程，检测产物特异性；结果表明，各个反应管均出现特异性扩增，VIC和FAM两种荧光能够准确指示样本线粒体DNA11778位点所含的碱基是G（VIC）还是A（FAM），所测结果呈现梯度分布，与标准品制作时所设定的梯度一致；正常对照VIC：y = ‑3.480x + 35.84，R² = 0.940 式（1）；患者突变FAM：y = ‑3.498x + 36.04，R² = 0.998 式（2）；（4）、单细胞裂解：首先配制单细胞专用裂解液，配制方法如下：单细胞专用裂解液10mL：包含KCL 0.0373g (分子量=74.55，终浓度50mM)、MgCl 20.0019g (或0.02mL 1M MgCl2，分子量=95.21，终浓度1.5mM)、0.1mL 1M Tris‑HCl (Tris 分子量=121.14，终浓度10mM) 、明胶 0.001g （明胶无固定分子量，终浓度0.1mg/ml）、0.064mL 70% NP‑40（终浓度0.45%）、0.045mL Tween 20（终浓度0.45%）、新鲜蛋白酶K 1.2mg (终浓度0.12mg/mL)，随后补充纯水至10mL；将单细胞、卵裂球、胚胎样本放入2mL单细胞专用裂解液中，震荡离心，55℃裂解2小时（或55℃过夜），95℃15min使裂解液失活，裂解完成后以14000转离心5min，取上清可直接用于Taqman体系进行检测，获得Ct值；（5）、单细胞线粒体拷贝数计算；对于仅含有正常序列的样本，根据式（1），代入VIC的Ct值y，计算一个反应体系中的正常序列的拷贝数；对于携带突变的样本，根据式（1）和式（2），代入VIC和FAM的Ct值y，计算正常序列和突变序列的拷贝数，进而通过以下公式计算比例：突变比例=突变序列拷贝数/(正常序列拷贝数+突变序列拷贝数)。