[发明专利]一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法

摘要

本发明公开了一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体，利用根癌农杆菌介导法转化黄花蒿悬浮细胞系，获得转基因黄花蒿植株。对转基因黄花蒿植株进行PCR基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛细胞发育情况及青蒿素含量进行观察与分析，筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。本发明获得的转基因黄花蒿中青蒿素含量显著提高，转iaaM基因的黄花蒿中青蒿素的含量最高可达21.6mg/g DW，是非转化黄花蒿含量的1.8倍。本发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

主权项

1.一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)黄花蒿腺毛细胞特异表达基因的载体重组构建：将黄花蒿腺毛特异启动子AaGTpro和iaaM基因构建到Ti质粒的T‑DNA区，以HPT基因为选择标记基因，以pWM101作为出发载体进行改造和载体构建；得到重组Ti质粒pWM101‑AaGTpro::iaaM，所述黄花蒿腺毛特异启动子AaGTpro的序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组Ti质粒pWM101‑AaGTpro::iaaM的序列如SEQ ID NO.8所示；(2)工程化根癌农杆菌的制备：构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404，经过抗生素筛选和分子检测验证工程农杆菌，培养工程农杆菌至对数生长后期；(3)黄花蒿悬浮细胞系的建立：将深绿色或淡黄色生长快、结构疏松颗粒状的黄花蒿愈伤组织置于MS液体培养基中，将愈伤轻轻夹碎，摇床150r/min，光照周期为16h/8h光暗交替，温度为25±2℃振荡培养；培养15—20d为悬浮细胞的快速增长且细胞活性较高期，选取该时期的直径在5mm以内的小细胞团及含有单细胞的黄花蒿悬浮细胞系悬浮液，备用；(4)黄花蒿悬浮细胞的共培浸染转化：将步骤(3)所得的黄花蒿悬浮细胞系悬浮液与步骤(2)中生长至对数生长后期的工程农杆菌共培2.5—3.5d，然后转入筛选培养基上培养；(5)转化细胞的筛选和获得抗性愈伤组织：经步骤(4)共培2.5—3.5d后的黄花蒿悬浮细胞经MS液体培养基冲洗后，置于含200mg/L羧苄青霉素和30mg/LHPT抗性的诱导愈伤及丛生芽分化的培养基上，培养至愈伤上有丛生芽的分化，获得抗性丛生芽并继代增殖；(6)诱导根分化和获得转基因植株：当抗性丛生芽生长至3—5cm大小时，将抗性丛生芽转移到生根培养基诱导根分化，分化后幼苗经过炼苗后移栽至营养基质中，获得转基因植株；(7)转基因植株的分子检测和腺毛细胞发育观察：提取转基因植株叶片的DNA，用PCR法进行目的基因的分子检测验证，通过体视荧光显微镜观察转基因植株叶片腺毛细胞的密度、大小及荧光强度，通过与对照比较，判断腺毛的发育情况，对腺毛发育具有显著促进的植株进行青蒿素含量测定；(8)建立转基因黄花蒿品系：筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。