[发明专利]一种基于免疫印迹鉴定古代丝织品的方法

摘要

本发明涉及文物检测领域，公开了一种基于免疫印迹鉴定古代丝织品的方法，本发明首先将现代四种蚕茧中的丝素蛋白提取出来，然后使用桑蚕丝素蛋白作为免疫原制备针对桑蚕丝素蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体，通过免疫印迹方法检测两种抗体对四种丝素蛋白是否具有非特异性结合从而制备得到特异性良好的抗体。然后，提取古代丝织品中的丝素蛋白，使用两种抗体采用免疫印迹的方法检测古代丝织品，判断古代丝织品是否为桑蚕丝织物。本发明一方面将对古代丝织品的鉴定结果可视化，另一方面明确的得到了单克隆抗体与多克隆抗体对样品区域分子量结合的差异，结果准确，可靠度高，同时也避免了假阳性结果的出现。

主权项

1.一种基于免疫印迹鉴定古代丝织品的方法，其特征在于包括以下步骤：1)分别取现代桑蚕茧、柞蚕茧、蓖麻蚕茧和栗蚕茧，分别以1∶90‑110的浴比在0.4‑0.6wt％的Na2CO3溶液中沸煮脱胶25‑35min，重复上述操作至少2次，然后将脱胶后所得的丝素纤维与溶液分开，使用温水冲洗之后常温干燥；2)配制铜乙二胺溶液，将步骤1)所得的四种丝素纤维分别溶解于其45‑55倍质量的55‑65℃的铜乙二胺溶液中，恒温保持50‑70min，降温至20‑30℃，用8‑10wt％醋酸调节溶液pH值至8‑9，紧接着使用滤纸过滤，然后使用截留分子量为7000‑9000kDa的透析袋透析处理，透析前24h，每隔1.5‑2.5h换一次水，24‑48h每隔5‑7h换一次水，之后每隔10‑14h换一次水，70‑80h后终止透析；将透析后的溶液冷冻干燥，制得四种蚕茧的丝素蛋白粉末，备用；3)采用桑蚕茧的丝素蛋白粉末作为免疫原分别免疫兔子和小鼠，制备得到针对桑蚕丝素蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体；4)采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS‑PAGE凝胶：搭置制胶架，短玻璃板朝里，长玻璃板朝外；将分离胶A液、分离胶B液、10％APS、四甲基乙二胺按重量比1∶1∶0.01∶0.001混合，注入搭好的两玻璃板之间，加入1mL异丙醇，置于37℃干燥箱中10min；待分离胶凝固，倒掉异丙醇；然后将浓缩胶A液、浓缩胶B液、10％APS、四甲基乙二胺按重量比1∶1∶0.01∶0.002混合，注入两块玻璃板之间至液体溢出，最后将梳子插入两块玻璃板之间放于37℃干燥箱中10min备用；5)使用免疫印迹的方法对步骤3)所得的两种抗体特异性进行检测：使用步骤4)制备的SDS‑PAGE凝胶，使用未染marker作为蛋白分子量标准物，其中桑蚕丝素蛋白，柞蚕丝素蛋白，蓖麻蚕丝素蛋白，栗蚕丝素蛋白为一组实验对象，同时在同一块胶上建立两组该组实验，样品在浓缩胶中控制电压80v，样品在分离胶中控制电压120v，待溴酚蓝前沿到达凝胶底部停止电泳，在化学发光成像仪中可观察电泳结果；紧接着将电泳分离之后的蛋白在300mA，冰水浴条件下50‑70min转印到聚偏氟乙烯膜上，在化学发光成像仪中可观察转印结果；在室温摇床上使用20‑30mL的0.4‑0.6wt％的脱脂奶粉溶液封闭聚偏氟乙烯膜上的非特异性结合点，封闭时间控制在1‑2h，待封闭结束后，把聚偏氟乙烯膜上重复的两组实验剪开，标记为“膜一”，“膜二”，然后使用步骤3)制得的20‑30mL两种抗体(经TBST缓冲液稀释2500‑3500倍后)，分别孵育封闭之后的“膜一”，“膜二”1‑2h，接着分别使用TBST缓冲液洗涤2‑4次后，分别加入20‑30mL的HRP标记的羊抗兔抗体或者HRP标记羊抗鼠抗体：具体为向孵育多克隆抗体的聚偏氟乙烯膜中加入HRP标记羊抗兔抗体，向孵育单克隆抗体的聚偏氟乙烯膜中加入HRP标记羊抗鼠抗体，保持室温在摇床上孵育1‑2h，然后均使用TBST缓冲液洗涤2‑4次；接着分别向两张聚偏氟乙烯膜上加入0.8‑1.2mL显色液，避光反应4‑6min后移至化学发光成像仪中观察免疫结果；若两种抗体只结合桑蚕丝素蛋白，说明两种抗体具有高特异性；若两种抗体与柞蚕丝素蛋白，蓖麻蚕丝素蛋白和栗蚕丝素蛋白中的任意一个发生结合，说明两种抗体特异性差，不能用于蚕丝鉴别；6)取一份古代丝织品样品，对其进行预处理；首先在乙醇水溶液中常温浸泡25‑35min，然后离心处理，取下层物质，用蒸馏水冲洗后常温干燥，采用步骤2)方法提取古代丝织品样品中的丝素蛋白；7)采用步骤3)所获得的两种抗体通过免疫印迹方法对古代丝织品样品的丝素蛋白进行检测鉴定，若两种抗体均检测到，说明该古代丝织品样品为桑蚕丝织物；若抗体均没有检测到，说明该古代丝织品样品不是桑蚕丝织物；若只有一种抗体检测到而另一种抗体没有检测到，则需结合其他方法共同佐证结果。