[发明专利]过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用

摘要

本发明提供一种过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用，本发明的方法是通过PCR技术扩增博落回中参与生物碱代谢的关键基因小檗碱桥接酶(BBE)全长编码序列并结合In‑Fusion同源重组法高效率载体构建技术将博落回中BBE基因成功整合到植物表达载体pCAMBIA2301D，然后利用农杆菌介导的方法将表达载体导入至博落回外植体中，以提高博落回中BAIs(苄基异喹啉类生物碱)的含量。本发明方法获得的过表达博落回阳性植株中的一些BAIs，如(S)‑网状番荔枝碱、(S)‑金黄紫堇碱、(S)‑华紫堇碱、(S)‑四氢非洲防己碱的含量均得到了显著提高，约提高3倍左右，能为深入研究BBE基因功能和提高博落回中苄基异喹啉类生物碱的含量提供前期基础。

主权项

1.一种过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1、目的基因克隆：对博落回体内催化(S)‑网状番荔枝碱，产生(S)‑金黄紫堇碱的功能基因McBBE，即目的基因，进行克隆；基因McBBE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；S2、过表达载体构建：利用双酶切对表达载体进行酶切，然后进行Infusion反应将步骤S1克隆的目的基因McBBE整合到切割好的表达载体中，构成过表达载体；S3、农杆菌转化以及过表达博落回阳性植株的获得：S31、农杆菌的转化：将构建好的过表达载体加入到已在冰上融化的农杆菌感受态中进行转化，然后对转化完成的农杆菌进行培养，接着挑取已长出的单菌落做菌落PCR鉴定，选择阳性菌落标号并进行PCR克隆，然后测序、培养、保存，即制得农杆菌浸染液；S32、用转化后的农杆菌真空介导法浸染博落回外植体：用步骤S31制备好的农杆菌侵染液倒入博落回无菌组培苗外植体浸染，置25～30℃摇床上80～120rpm慢摇8～12min，然后置于真空冷冻干燥机中连续抽真空8～12min；S33、培养获得博落回植株：将浸染后的无菌组培苗外植体培养得到博落回愈伤组织；待愈伤组织分化长出抗性芽然后转至生根筛选培养基进行扩繁；S34、采用GUS染色筛选过表达博落回阳性植株。