[发明专利]一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法

摘要

本发明是一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，通过种子消毒、种子培养、烟草外植体预培养、发根农杆菌培养、侵染与共培养、清洗与发状根培养、发状根愈伤组织培养、分化芽培养、再生植株生根培养等步骤完成。本发明针对烟草品种红花大金元，利用发根农杆菌，通过调节植物激素比例，提高其外植体产生愈伤组织比率，可将烟草组织培养产生新植株的时间缩短至2个月并提高组培苗的生产率。另外，经过分化芽培养步骤，能大大提高分化芽的生根率和存活率。

主权项

1.一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1），红花大金元种子消毒；步骤（2），种子培养，将步骤（1）中消毒的种子接种到MS培养基中，待发芽长成幼苗；种子发芽培养条件：温度25±1℃，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d，培养60d；步骤（3），烟草外植体预培养，将步骤（2）中得到的幼苗，利用手术刀将烟草叶片切成1cm2左右的叶盘，将叶盘置于MS培养基中进行预培养，培养条件为：25℃，黑暗培养3d；步骤（4），发根农杆菌培养，发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2‑3d，挑取发根农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600 =0.5‑1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600 =0.6‑0.8，供感染使用；步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；步骤（6），清洗与发状根培养，将步骤（5）中共培养3d的叶盘取出，用含有250mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗，在灭菌滤纸上吸干水分，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行发根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14d；步骤（7），发状根愈伤组织培养，将步骤（6）中从叶盘边缘长出的发状根切下，约1‑1.5cm长，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基中进行分化愈伤组织培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14‑21d，每10d更换培养基；步骤（8），分化芽培养，将步骤（7）中已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2‑4cm高，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，10d；步骤（9），再生植株生根培养，将步骤（8）中分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，7‑10d。