[发明专利]一种建立大肠癌HK2报告基因细胞系的方法

摘要

本发明公开了一种建立大肠癌HK2报告基因细胞系的方法，具体为：先设计HK2基因位点特异性sgRNA序列，克隆进质粒PX459；整合HK2基因同源重组序列以及绿色荧光蛋白DNA片段(EGFP)，将上述质粒和整合片段共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；筛选的EGFP表达细胞系通过PCR鉴定及免疫印迹验证阳性HK2报告基因细胞系。该大肠癌细胞系HK2基因和EGFP共同表达，其EGFP表达水平和HK2基因具有高度一致性，故通过检测EGFP表达水平变化可以准确判断HK2基因表达水平。本发明建立细胞系方法简单、易行、高效和精准定位基因位点。

主权项

1.一种建立大肠癌HK2报告基因细胞系的方法，包括以下步骤：步骤1：HK2基因下游位点特异性HK2‑sgRNA序列设计及评估；其中，HK2‑sgRNA序列可选自：HK2‑sgRNA1：TAGAACCCCTGAAATCGGAA(chr2:74890939‑74890958)，如SEQ ID NO.1所示；或HK2‑sgRNA2：TGTGTCAGAGACAGACCCCT(chr2:74891015‑74891034)，如SEQ ID NO.2所示；步骤2：构建pX459/HK2‑sgRNA质粒；步骤3：整合HK2基因的同源重组序列和EGFP片段；步骤4：将上述质粒pX459/HK2‑sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；步骤5：通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；步骤6：筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定HK2报告基因细胞系；所述步骤2中，构建pX459/HK2‑sgRNA质粒的方法如下：根据所述HK2‑sgRNA1或所述HK2‑sgRNA2的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459/HK2‑sgRNA1或pX459/HK2‑sgRNA2；步骤3中，整合HK2基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下：根据HK2基因的同源重组序列和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L‑EGFP‑R；所述片段L‑EGFP‑R的序列如SEQ ID NO.3所示。