[发明专利]一种DA单克隆抗体免疫亲和柱在测定软骨藻酸类毒素中的应用

摘要

本发明涉及一种免疫亲和柱，尤其是涉及一种DA单克隆抗体免疫亲和柱制备方法，通过筛选出对DA毒素具特异性的抗体从而制得一种高性能、强识别的DA单克隆抗体免疫亲和柱，得到的DA单克隆抗体免疫亲和柱可应用于不同海洋生物中DA毒素的分析测定，有效解决前处理中样品净化不理想的问题，并减少样品基质干扰，缩短分析时间，提高方法回收率，填补免疫亲和技术在DA毒素检测领域的空白。本发明还提供了一种DA单克隆抗体免疫亲和柱的应用。

主权项

1.一种DA单克隆抗体免疫亲和柱制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成免疫原在小烧瓶中依次加入10mg的牛血清白蛋白，2mL 0.05M、pH7.4的乙酸钠缓冲液，1mg的软骨藻酸，60μL质量浓度为37％的甲醛溶液，混匀，37℃搅拌48h，然后用0.1M、pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，得免疫原DA‑BSA；(2)合成检测原在小烧瓶中依次加入10mg的鸡卵清白蛋白，2mL 0.05M、pH7.4的乙酸钠缓冲液，1mg的软骨藻酸，60μL质量浓度为37％的甲醛溶液，混匀，37℃搅拌48h，然后用0.1M、pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，得检测原DA‑OVA；(3)单克隆抗体制备及纯化取5只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多点注射DA‑BSA，20μg/只，免疫4周后开始加强免疫，每隔2周加强免疫1次；初次免疫时，用免疫原DA‑BSA与等体积弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用免疫原DA‑BSA与等体积弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量、免疫方式不变；第2次加强免疫10天后，取小鼠尾静脉血检测，包被检测原DA‑OVA，用间接竞争ELISA法检测血清的效价，选择效价最高的BALB/c小鼠用于制备杂交瘤细胞，融合前3天小鼠腹腔加强免疫一次，取效价最高的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，筛选获得杂交瘤细胞；BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，8天后向小鼠腹腔内注射1×107个杂交瘤细胞，10天后开始用注射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1天抽取腹水1次，离心，收集上清液，采用饱和硫酸铵法纯化上清液，再用ProteinG亲和层析法进一步纯化获得DA单克隆抗体；(4)亲和柱制备称取0.5g CNBr活化的溴化氢活化琼脂糖凝胶4B干粉用100mL 1M的HCl溶液溶胀，并洗涤；再用100mL偶联缓冲液洗涤得凝胶；取1.5mL溶胀后的凝胶，加入1.5mL 10mg/mL的DA单克隆抗体，室温振荡偶联反应2h，抽滤，并用30mL偶联缓冲液洗涤凝胶，抽滤，加入10mL封闭缓冲液，室温振荡反应2h，抽滤，再用100mL 0.01M、pH7.3的PBS缓冲液洗涤凝胶，并转移到5mL柱管中，加入含有质量浓度分别为0.05％硫柳汞、0.05％牛血清白蛋白的0.01M、pH7.3的PBS溶液，于2～8℃储存。