[发明专利]一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用

摘要

本发明中公开了一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用，通过CQW1毒株(GenBank：KM233707.1)的反向遗传操作系统，对鸭坦布苏病毒基因组的第1‑2646核酸片段进行改造，将NanoLuc报告基因插入到TMUV病毒的5’UTR和结构基因之间，构建报告病毒的全长cDNA感染性克隆。本发明对报告病毒的构建进行优化，并更换报告基因，从而有效提高报告病毒的传代稳定性，拯救出的报告病毒在5代以内不会丢失报告基因；同时减少构建重组质粒时所使用的引物及扩增基因片段的数量，减少反应步骤，简化工序，方便操作，有效的缩短了获得报告病毒的周期，降低了生产成本。

主权项

1.一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、以pACYC FL‑TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，PCR扩增得到片段A；以pJET‑NanoLuc质粒为模板，以序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增得到片段B，所述pJET‑NanoLuc质粒含有NanoLuc报告基因；以pACYC TMUV‑RLuc质粒为模板，以序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，PCR扩增得到片段C；b、以步骤a中的序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4为引物，以片段A和片段B为模板进行熔合PCR扩增，得到片段AB；再以步骤a中的序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6为引物，以片段AB和片段C为模板，进行第二轮熔合PCR扩增，获得片段ABC；c、将pACYC FL‑TMUV质粒用限制性内切酶SpeI和XhoI进行双酶切，并回收纯化，获得纯化的线性pACYC FL‑TMUV质粒载体；d、将步骤b中所述的片段ABC与步骤c中线性化的pACYC FL‑TMUV质粒载体进行重组连接，获得重组质粒，命名为pACYC TMUV‑NLuc质粒；e、将步骤d中的pACYC TMUV‑NLuc质粒进行体外RNA转录，然后将体外转录获得的RNA转染BHK21细胞，从而拯救出报告病毒TMUV‑NLuc。