[发明专利]一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物细菌回复突变实验的方法

摘要

本发明公开一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物细菌回复突变实验的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理；(2)受试菌的培养；(3)受试菌浓度的确定；(4)S9混合液的配制；(5)受试物的分组；(6)受试物的培养；(7)结果判定。本发明建立了加热不燃烧卷烟总粒相物样品前处理方法，并确定了样品检测剂量，形成了适合加热不燃烧卷烟总粒相物的细菌回复突变试验方法。本发明样品的有效处理、检测剂量的优化设定，使得本发明方法能够准确有效的检测加热不燃烧卷烟总粒相物的遗传毒性。

主权项

1.一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物细菌回复突变实验的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；mTPM＝m1‑m0     (1)式中：m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，‑80℃保存待用；(2)受试菌的培养：将TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌分别加入到装有培养基的无菌三角瓶中，置于37℃条件下，静置培养16h或100次/min振荡培养10h；(3)受试菌浓度的确定：用紫外分光光度计分别测定步骤(2)培养所得TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌在600nm下的OD值，然后用培养基稀释菌液至其OD600值为0.5数；(4)S9混合液的配制：将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照1:1的体积比混合后配制成氯化钾‑氯化镁溶液；取磷酸缓冲液、氯化钾‑氯化镁溶液、0.05mol/L的葡萄糖‑6磷酸钠盐缓冲液和0.025mol/L的辅酶‑Ⅱ溶液，按照30:2:5:8的体积比混合，用0.22μm无菌过滤器过滤除菌后，与S9代谢活化液按照9:1的体积比混合，配制成S9混合液备用；(5)受试物分组：将受试物分为四组：自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组和样品测试组；把步骤(1)中制备的样品用PBS稀释成1000μg/mL的工作液备用，其中，样品测试组按表1所示的不同剂量将工作液加入15ml离心管中；自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组则按表2所示的不同剂量将工作液加入15ml离心管中；将自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组、样品测试组样品分别按表3所示的4个检测体系加样；(6)受试物的培养：将步骤(5)中的各组受试物分别加入到2.0mL，40℃水浴保温的0.6％(W/V)琼脂顶层培养基中，混匀后迅速倒入1.8％(W/V)琼脂底层培养基中，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，每个剂量设3个复皿，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，观察结果；(7)结果判定：计算培养长出的回变菌落数，在背景生长良好的条件下，样品测试组诱发的回变菌落数等于或大于自发回变组菌落数的2倍以上，并有剂量效应关系，即认为样品测试组试验结果为阳性。