[发明专利]一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法

摘要

一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，属于发酵工程技术领域。首先，通过代谢工程改造，把来自土肉桂(Cinnamomum osmophloeum)的芳樟醇合成酶在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae BY4742‑MC‑01)中异源表达,为增加芳樟醇生物合成效率，在酿酒酵母的线粒体中完整构建了甲羟戊酸等途径(MVA)充分利用了在线粒体和细胞质共同参与合成芳樟醇，通过碳源优化，在摇瓶发酵中实现芳樟醇产量达8.5mg/L，进一步对发酵液进行精馏处理，获得高纯度的芳樟醇(纯度≥90％)。

主权项

1.一种芳樟醇生物合成及纯化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)首先，把来自酿酒酵母的香叶基焦磷酸合成酶基因(ERG20)，设计了三个突变位点(F96W、N127W、K197G)，并人工合成出有三个点突变的ERG20基因，即ERG20F96W‑N127W‑K197G，以下用ERG20*表示；(2)其次，通过融合PCR方法，把基因ERG20*与来自土肉桂(Cinnamomum osmophloeum)的芳樟醇合成酶基因(LIS)进行基因融合，获得融合基因LIS‑ERG20*；(3)然后，通过人工合成的方法，合成出带线粒体定位信号肽的LIS基因即MLS‑LIS，再把融合基因LIS‑ERG20*和带有线粒体定位信号肽的LIS基因MLS‑LIS克隆到质粒pESC‑URA上，获得共表达载体(pESC‑URA‑LIS‑ERG20*/MLS‑LIS)；最后，把共表达载体转化到酿酒酵母中，即为高产芳樟醇的酿酒酵母重组菌YMC‑01LIS‑ERG20*/MLS‑LIS；(4)在酿酒酵母重组菌YMC‑01LIS‑ERG20*/MLS‑LIS的摇瓶发酵培养中，优选并进一步在发酵液中添加甲羟戊酸或甲羟戊酸内酯或丙酮酸或丙酮酸盐作为碳源，进一步提高发酵液中芳樟醇含量，对发酵液进行精馏处理，即可得到纯度≥90％的芳樟醇；甲羟戊酸的含量为0‑100g/L；丙酮酸的含量为0‑10g/L。