[发明专利]一种活性污泥TTC脱氢酶活性测定方法

摘要

本发明公开一种活性污泥TTC脱氢酶活性测定方法，包括两个部分：标准曲线制作和样品测定；其中，标准曲线制作：标准曲线制作包括酶反应、萃取测试和线性回归三个步骤；其中，样品测定：样品测定包括酶反应、萃取测试和定量分析三个步骤。采用Na₂S为还原剂，提高了还原产物TF的稳定性。用滴管去除上清液，再加丙酮，之后用蒸馏水定容的方式，避免了因污泥悬浮造成的TF损失，并且使丙酮的比例保持在83.3％，保证了结果的精确性。本发明通过漩涡振荡混匀的方式，提高对污泥中TF的萃取率；通过用滤膜过滤萃取液的方式，避免了污泥悬浮对最后测定结果的影响。

主权项

1.一种活性污泥TTC脱氢酶活性测定方法，其特征在于，包括两个部分：标准曲线制作和样品测定；1)标准曲线制作：标准曲线制作包括酶反应、萃取测试和线性回归三个步骤；(1)酶反应：将TTC储备液稀释成一系列不同浓度TTC使用液，在10mL离心管中依次加入TTC使用液1mL，2mL Tris‑HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水和1mL新配的10％的Na2S，漩涡振荡混匀后，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min‑1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1mL刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，在485nm处读取萃取液吸光度A；(3)线性回归：以TTC浓度为横坐标，TF萃取液的A值为纵坐标作图，即得到TTC‑A标准曲线，对标准曲线进行线性回归，即得标准方程：y＝kx‑b式中，x为反应体系的TTC浓度(mg·L‑1)，y是TF萃取液的A值；2)样品测定：样品测定包括酶反应、萃取测试和定量分析三个步骤；(1)酶反应：在10mL离心管中依次加入1mL活性污泥样品、2mL Tris‑HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水和1mL0.4％TTC溶液；对照组依次加入1mL活性污泥样品、2mL Tris‑HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水、0.5mL甲醛溶液后和1mL0.4％TTC溶液；漩涡振荡混匀，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，除对照组以外，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min‑1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1mL刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，漩涡振荡一分钟，0.22μm有机滤膜过滤，在485nm处读取萃取液吸光度A；(3)定量分析：通过标准曲线计算TF的生成量式中，UI为TTC‑比脱氢酶活性(mg TTC·g‑1·min‑1)，V为萃取剂体积(mL)，k为TTC‑A标准曲线的斜率，W为污泥样品的干重(mg MLSS)，t为酶促反应时间(min)。