[发明专利]一种基于金纳米簇锚定羟基氧化钴纳米片的吡虫啉荧光免疫分析方法

摘要

本发明公开了一种基于金纳米簇锚定羟基氧化钴纳米片的吡虫啉荧光免疫分析方法，属于生物传感器技术领域，本发明通过金纳米簇锚定在二维羟基氧化钴纳米片表面，形成纳米复合材料，导致荧光强度显著降低。通过引入能够触发CoOOH纳米片分解的抗坏血酸，可有效逆转猝灭效应。值得注意的是，抗坏血酸诱导的相应荧光反应与抗体标记的ALP活性有关。经过竞争免疫反应后，ALP标记的抗体可与固定化抗原相结合，可调节检测平台的荧光变化。利用系统的荧光切换，FIA对吡虫啉的检测浓度(IC50)为1.3ng mL‑1，比常规ELISA(86.4ng mL‑1)敏感60倍。本发明的荧光免疫分析方法能够实现靶抗原吡虫啉的高灵敏检测，不仅为农药检测开辟了新的前景，而且为荧光免疫分析开辟了有效的策略。

主权项

1.一种基于金纳米簇锚定羟基氧化钴纳米片的吡虫啉荧光免疫分析方法，其特征在于，其步骤如下：A、羟基氧化钴纳米片(CoOOH NPs)的制备：首先制备CoOOH纳米片，将KOH和CoCl2按体积比1:4混合，然后超声1‑5min；将NaClO相比上述混合液体积比1:55加入上述溶液中，继续超声10‑15min，然后10000rpm离心10‑15min，收集CoOOH NPs产物；去离子水洗涤三次，冷冻干燥得到的CoOOH NPs黑色粉末；最后，将CoOOH NPs用去离子水溶解稀释至0.025mg mL‑1备用；B、谷胱甘肽功能化的金纳米簇AuNCs制备：将HuCl4和GSH按照体积比1:4混合，在1500r/min磁力搅拌过程中加入8倍体积的超纯水；然后，将上述混合物加热到70‑80℃反应24小时以上，即可获得黄色AuNCs溶液，通过透析进行纯化，并通过冷冻抽干获得黄色AuNCs粉末，最后超纯水溶解稀释至0.20mg mL‑1备用；C、CoOOH‑AuNCs复合材料的制备：将步骤一的CoOOH NPs溶液和步骤B制备的AuNCs溶液等体积混合，并超声处理10‑15分钟，然后将混合溶液在10000rpm下离心10‑15分钟，10mL去离子水溶解沉淀，得到CoOHO‑AuNCs复合材料溶液；D、吡虫啉的荧光免疫分析：取200μL包被抗体加入到96孔板，37℃孵育2h，包被板用300μL小牛血清37℃封闭60min；然后取不同浓度的吡虫啉(imidacloprid，50μL和抗吡虫啉多克隆抗体加入孔板中37℃孵育60min，而后加入碱性磷酸酶(ALP)标记的二级抗体再次37℃孵育60min；随后，加入100μL的L‑抗坏血酸‑2‑磷酸(AAP)37℃反应60min，将上述反应液与CoOOH‑AuNCs复合物(100L)和100μL的Tris‑HCl缓冲液37℃混合反应10min，然后进行信号放大和指示，最后，加入1700μL的超纯水，进行荧光检测并记录。