[发明专利]一种呼吸道病原体多重检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，基于多重PCR技术，采用荧光能量共振转移通过熔解温度范围判定检测结果，可用于定性同时检测16种呼吸道病原体，包括12种RNA病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、副流感病毒‑1/‑2/‑3型、冠状病毒OC43型、冠状病毒229E型、鼻病毒和人偏肺病毒)，2种DNA病毒(腺病毒和博卡病毒)以及2种细菌(肺炎支原体和百日咳鲍特菌)，具有检测灵敏度高，灵敏度甚至可高达1个拷贝/反应；特异性好，取样部位相同致病机理相似的非本试剂盒检测范围的病原体结果都为阴性；操作时间短且操作简单，结果清晰易判读等优点，可用于一个反应体系单管快速检测16种呼吸道病原体。

主权项

1.一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测十六种呼吸道病原体，包括扩增引物组、特异引物组和探针：所述扩增引物组由以下引物组成，其中用于扩增呼吸道合胞病毒A型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F1：5’‑TCCCATAATATACAAGTATTATCTC‑3’；R1：5’‑AACCCAGTGAATTTATGATTAGC‑3’；用于扩增腺病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F2：5’‑GACATGACCTTCGAGGTGGACCCCA‑3’或5’‑GACATGACTTTTGAGGTGGATCCCA‑3’；R2：5’‑TTATGTGGTGGCGTTGCCGGC‑3’或5’‑TTACGTGGTAGCGTTACCGGC‑3’；用于扩增人偏肺病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F3：5’‑CAAAGAGGCAAGAAAAACAAT‑3’；R3：5’‑GCCTGGCTCTTCTGACTGTG‑3’；用于扩增呼吸道合胞病毒B型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F4：5’‑TGTGGTATGCTATTAATCACTG‑3’；R4：5’‑GGAGCCACTTCTCCCATCTC‑3’；用于扩增甲型流感病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F5：5’‑TCAGGCCCCCTCAAAGCC‑3’；R5：5’‑GGCACGGTGAGCGTGAA‑3’；用于扩增乙型流感病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F6：5’‑ATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTG‑3’；R6：5’‑GCATCTTTTGTTTTTTATCCATTC‑3’；用于扩增百日咳鲍特菌目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F7：5’‑GGCATCAAGCACCGCTTTAC‑3’；R7：5’‑CGGTGTTGGGAGTTCTG‑3’；用于扩增鼻病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F8：5’‑GCCTGCGTGGCTGCC‑3’；R8：5’‑CCTGCGTGGCGGCC‑3’；用于扩增肺炎支原体目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F9：5’‑GCAGACGGTCGGGGAT‑3’；R9：5’‑CGAACCAGGTGAGGT‑3’；用于扩增副流感病毒‑1型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F10：5’‑AGCCCTAGCAGACCTGAAG‑3’；R10：5’‑ATAGGGGTCTGATGCCCAGT‑3’；用于扩增副流感病毒‑2型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F11：5’‑AGTTCCTCGTCCTGGAGTCA‑3’；R11：5’‑TGATGCAGTTAGCAGGGC‑3’；用于扩增副流感病毒‑3型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F12：5’‑GCACAACTCATCCAACAGCC‑3’；R12：5’‑GTCTTGGGCTTGGATTCGGA‑3’；用于扩增博卡病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F13：5’‑CAAGCCTGACGTCTGCACT‑3’；R13：5’‑CTAGCAGCGGAAGCCCAT‑3’；用于扩增冠状病毒OC43型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F14：5’‑ATGTCGGTTTCGTTGAGGCT‑3’；R14：5’‑GCAGTGGAGGCAACACTT‑3’；用于扩增冠状病毒229E型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F15：5’‑CTGCAACCGTGTGACACTTG‑3’；R15：5’‑TCGGCATGCCCTAAAACCAT‑3’；用于扩增甲型H1N1流感病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F16：5’‑GGACAGTCAGTGGTTTCC‑3’；R16：5’‑CCCATCCACTAACAGGGCAG‑3’；用于扩增内部质控品目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F17：5’‑GCAATGCAAGGTCTCCT‑3’；R17：5’‑GGAAGATCAATACATAAAG‑3’；所述特异引物组由以下引物组成，其中用于使呼吸道合胞病毒A型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F1’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCTCTTAGCAAAGTCAAGTTGAATGATACACTC‑3’；R1’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACATGCCTAATGGTCCGCTGGATGACAGAAGTTGATCTTTGTT‑3’；用于使腺病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F2’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGTGCACAGCCICACCGC‑3’或5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGGAGTGCAICAGCCCICAICGC‑3’；R2’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACCAATCGCAATCGTGGCGCAGGTAIACGGIITCGATGACGCC‑3’或5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGCCCAATCGCAATCGTGGCGTGCGCAGGTAIACIGIITCGATGAIGCC‑3’；用于使人偏肺病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F3’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACAAGTCAGAGGCCTTCAGCACCAG‑3’；R3’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGATAGACCAGAAGTGAACGCATCTGCACCTACACATAATAAAATTATIGGTGTGT‑3’；用于使呼吸道合胞病毒B型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F4’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGGGTTAGGAAGGGAAGACACTATAAAGATACTT‑3’；R4’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAACTAGGAGAGTGGTCAGGATTGGCCCATTAGCTTTAACATGATATCCAGCATCTTT‑3’；用于使甲型流感病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F5’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCTTGAGGCTCTGATGGAITGGCT‑3’；R5’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACACGGCAGGTCCGGTATCAGTTGCTTCGGTATCAGTTGCTTCGAGGTGACAIGATTGGTCTTGTCTTT‑3’；用于使乙型流感病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F6’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGTCATTIACAGAAGATGGAGAAGGCA‑3’；R6’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGATAGCTCGCCATCACACGTCTCGCTGTTGACCATCTCGACAGTGTAATTTTTCTGCTAGTTCTGCTT‑3’；用于使百日咳鲍特菌目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F7’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCCGAACGCTTCATCCAGTCGG‑3’；R7’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAACTAGTAGTCAGGCACGCGTAAGCCCACTCACGCAAGG‑3’；用于使鼻病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F8’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCCICGTGTGCTCIITITGAITCCTCCGG‑3’；R8’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGATGTCCTTGGGTCCCTCTTGGGCTCCIIIGTTAGGATTAGCCGCATTCAGGGG‑3’；用于使肺炎支原体目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F9’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGGGCCCCIATCGCCCTC‑3’；R9’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACATTGCGTCAAGTTGCTTATCAATGTTGAGCGTAAGATGGACCAGGGCGAAGTACGITTCAAACGG‑3’；用于使副流感病毒‑1型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F10’：5’‑CAGGATGTGTTAGACTACCTTCATTATCAATTGGT‑3’；R10’：5’‑GATGCAATATATGCGTATTCATCAAACTTAATCACTCAAGGATGTGC‑3’；用于使副流感病毒‑2型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F11’：5’‑CAGGACTATGAAAACCATTTACCTAAGTGATGG‑3’；R11’：5’‑AATCAATCGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACCAGGAGGTTGT‑3’；用于使副流感病毒‑3型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F12’：5’‑CCATCTGTTGGACCAGGGATATACTACAAA‑3’；R12’：5’‑GGCAAAATAATATTTCTCGGGTATGGAGGTCTTGAACATCCAACCCAGTTGTGTTGCAG‑3’；用于使博卡病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F13’：5’‑ACCTAAACGAATCTTGTAATAGGCACCTAICCAATTC‑3’；R13’：5’‑CGCAATCAATATAAATTCTTAACAGTAAACAGTGCATTAACCATTCACTAC‑3’；用于使冠状病毒OC43型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F14’：5’‑CCCAGAGACCTTGACCACAACTTTGGAAGT‑3’；R14’：5’‑GCAGGTGTTGTGGCCAATGGTGTTAAAGCTAAAGGC TATC‑3’；用于使冠状病毒229E型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F15’：5’‑CTATTGCACCAGGAGTCCCAGCTACTGAA‑3’；R15’：5’‑GCTAAGGGGTACTGGTACAGACACAACAGACGTTCTTT TAAAAC‑3’；用于使甲型H1N1流感病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F16’：5’‑CGAACCTTCAACTTTAACAGTCCTATATTCGACTTACGA‑3’；R16’：5’‑TCAAGCTTACAATTAGCAGGCATCTTAGCCAGGACCTATTACGCACATTCATGC‑3’；用于使内部质控品目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：F17’：5’‑GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGTTTGAATGGCCGGCGTCTATTAG‑3’；R17’：5’‑GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAAGCAGCTTCTGGGAGAAGACCACGCAGCAAACTCCGGCATCTA‑3’；所述检测探针组包括以下检测探针，其中：与呼吸道合胞病毒A型或副流感病毒‑1型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P1：5’‑GGACCATTAGGCATG‑3’；与腺病毒或副流感病毒‑2型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P2：5’‑CCACGATTGCGATTGG‑3’；与人偏肺病毒或副流感病毒‑3型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P3：5’‑AGATGCGTTCACTTCTGGTCTA‑3’；与呼吸道合胞病毒B型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P4：5’‑GCCAATCCTGACCACTCTCCTAGT‑3’；与甲型流感病毒或博卡病毒探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P5：5’‑GAAGCAACTGATACCGGACCTGC‑3’；与乙型流感病毒探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P6：5’‑CGAGATGGTCAACAGCGAGACGTGCGATGGCGAGCTA‑3’；与冠状病毒OC43型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P7：5’‑CCGCTAATCCACGTAACGACCTG‑3’；与百日咳鲍特菌探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P8：5’‑CGTGCCTGACTACTAGT‑3’；与鼻病毒或冠状病毒229E型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P9：5’‑CCAAGAGGACCCAAGGACA‑3’；与肺炎支原体探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P10：5’‑GTCTTACGCTCAACATTGATAAGCAACTTGACGCAATG‑3’；与检测甲型H1N1流感病毒探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P11：5’‑GCTACCACTCAATTAGTATTACTACCT‑3’；与内部质控品探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：P12：5’‑TCACGAGCTACAGCAGGT‑3’；所述试剂盒的使用方法为：从待测样品中提取核酸为模板，利用所述扩增引物组中的所有引物，进行RT‑PCR预扩增；以上述RT‑PCR预扩增产物为模板，利用所述特异引物组中的所有引物和所述检测探针组中的所有探针，通过以下PCT扩增程序进行实时荧光定量PCR：95℃预变性2分钟；94℃变性15秒、55℃退火15秒、72℃延伸15秒，10个循环；94℃变性15秒、50℃退火15秒、72℃延伸15秒，23个循环；95℃变性2分钟；40℃进行熔解准备90秒；以1℃/s速度从40℃升温90℃进行熔解程序，在此过程中选用FAM、ROX和Cy5荧光检测通道进行荧光检测，收集荧光并判定结果。