[发明专利]一种维持和恢复毛乳头细胞干性的外泌体制剂

摘要

本发明公开了一种维持和恢复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，该制剂通过以下方法制得：1）DPC的分离获取；2）外周血单个核细胞的分离；3）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞筛选；4）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基的获取；5）DPC诱导培养基的配置；6）DPC的诱导培养；7）外泌体制剂的制备。该方法避免CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在直接应用（细胞移植）中的免疫排斥和替代方法(transwell)中的共培养成本费用高的问题，在DPC培养中能回复高代次毛乳头的细胞干性。

主权项

1.一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于该制剂采用以下方法制备：1）毛乳头细胞（DPC）的分离获取，采集患者后枕部区域单位毛囊组织，采用改良二步酶消化法进行实验室DPC的分离培养；2）外周血单个核细胞的分离，抽取肝素抗凝静脉血30mL，取6 个15mL离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液5mL，将5mL 外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000r/min 20℃离心20min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS 洗涤2次备用；3）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞筛选，MACS 分选上述步骤获得的外周血单个核细胞进行细胞计数，加PBS洗涤，1200r/min 离心后弃上清，以MACS buffer 90μL/每107个细胞重悬，加入CD4+T 细胞Biotin⁃Antibody10μL/每107个细胞，混匀，进行第一次孵育，第一次孵育结束后加入20μLAnti⁃Biotin MicroBeads/每107个细胞，混匀，进行第二次孵育，第二次孵育结束后，以MACS buffer将细胞调整至500μL体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为CD4+T 细胞（阴选），将细胞洗涤离心后，以MACS buffer 90μL/每107个细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，进行第三次孵育，第三次孵育结束后，加入1‑2mL MACS buffer 洗涤离心，倾去上清，重悬至500μL，过MS 柱，把separator移开，放置1mL MACSbuffer于MS 柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为CD4+CD25+T细胞（阳选）；4）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基的获取，将筛选获取的CD4+CD25+Treg细胞接种于细胞培养袋，培养15d后，吸取培养基于250ml离心管，800g离心10min，上清液即为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基；5）DPC诱导培养基的配置，将步骤4）中所获取的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基与DPC培养基混合，所得培养基即为DPC诱导培养基；6）DPC的诱导培养，待第三代DPC铺满率为70%时，换DPC培养基为DPC诱导培养基，培养48h后，更换培养基为DMEM基础培养基；7）外泌体制剂的制备，在不含血清的DMEM基础培养基中培养48h后，收集细胞培养上清液，经超速离心法获取外泌体；用生理盐水或DMEM溶解为含DPC外泌体浓度为1*1010颗粒/ml的溶液，即得外泌体制剂。