[发明专利]一种无饲养层的大鼠精原干细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种无饲养层的大鼠精原干细胞的分离培养方法，从出生后7‑9天的雄性大鼠乳鼠睾丸中分离精原干细胞，通过差异贴壁和percoll分离可获得较高纯度的大鼠精原干细胞，所得大鼠精原干细胞使用无滋养层培养体系培养，可长期稳定传代且可向精子发生方向分化。本发明分离培养方法成本低、操作简便，获得的精原干细胞数量可倍增，对于不孕不育的治疗以及濒临灭绝物种资源的保护具有重要意义。

主权项

1.一种无饲养层的大鼠精原干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、原代分离大鼠精原干细胞：从出生后7‑9天的雄性大鼠乳鼠睾丸中分离精原干细胞，通过差异贴壁和percoll分离获得大鼠精原干细胞，步骤一具体过程为：取7‑9天WISTAR雄性大鼠，剖开睾丸白膜，分离暴露曲细精管，加入4ml的HBSS溶解的10μg/ml的IV型胶原酶置于37℃消化；再使用3ml体积的300μg/ml的DNAse洗2‑4次，600g离心后沉淀，加入4ml含1mM浓度EDTA的0.25％胰酶轻轻吹打37℃消化；10％血清终止消化后过筛网移除未消化的大块组织；于600g离心5分钟，弃去上清；将细胞以2ml培养基重悬后，加入到预先铺有50％、35％、25％、10％各1ml的percoll使用液的采血管中，整个percoll体系以600g离心50分钟；待离心后，可见50％与35％之间出现密集细胞带，吸出成带部分组分，HBSS清洗两遍后，以3×10⁷个/ml接种培养；步骤二、对分离出的大鼠精原干细胞使用无饲养层培养体系培养，步骤二具体过程为：采用含150ng/ml GFRα1、20ng/ml EGF、10ng/ml bFGF的10％血清DMEM/F12培养基，培养基补充成分为6g/L葡萄糖、25mg/L胰岛素、10^‑4mol/L维生素C、10mg/L生物素、非必须氨基酸补充液、维生素补充液；4h后移取悬浮细胞组分单独培养，隔天换液，3‑4天传代；待3‑4日培养后，细胞融合至80％，移去半数上清液，将下层悬浮细胞轻轻吹起，收集后以1：2均匀传代并补充培养基。