[发明专利]一种内肽酶活力测定的新方法

摘要

本发明涉及一种内肽酶活力测定的新方法；是以牛血清白蛋白为底物，根据内肽酶特征产物肽的显色反应，测定反应前后反应体系吸光度值，同时用能反应体系中肽含量多少的标准物绘制标准曲线，通过查标准曲线确定反应前后产物肽含量的变化，从而对内肽酶准确定量。本发明克服了常规内肽酶活力测定过程中蛋白质以及氨基酸的干扰，能快速准确测定内肽酶活力,操作简单，快速。

主权项

1.一种内肽酶活力测定的新方法，其特征在于，步骤如下：1)标准曲线的绘制以缩二脲浓度(mg/mL)为横坐标x，吸光度OD值为纵坐标y，绘制标准曲线方程：y＝ax+b(r2≥0.99)，变形得方程‑1：x＝(y‑b)/a；方程中a，b为常数，分别代表曲线与x轴和y轴的交点；2)粗酶液提取对于固体样品，先粉碎过80目筛；测定固体样品粉末的水分含量，记为w；取粉碎后的待测固体样品适量，记为m，加入样品质量4倍的pH5.2、浓度为0.1mol/L的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，4℃条件下磁力搅拌30min，用pH5.2，浓度为0.1mol/L的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液定容至V；4℃条件下过滤收集上清液作为待测粗酶液；对于液体样品直接取样，记为V0，置于冰浴中，缓慢加入95％乙醇溶液，使体系中乙醇的终浓度为60％v/v，静置沉淀后，抽滤，得湿酶粉；于4℃冰箱保存；测定酶活时，用浓度为0.05mol/L、pH6.0的柠檬酸―磷酸氢二钠缓冲液复溶并定容至V，即得到待测粗酶液；3)实验组的测定实验组设3个平行处理；每个平行处理分别取待测粗酶液，记为v，用浓度为0.2mol/L，pH4.5的醋酸‑醋酸钠缓冲溶液补足待测粗酶液至2mL；50℃水浴预热10min后加入牛血清白蛋白溶液1mL进行反应，加入牛血清白蛋白溶液后在50℃水浴中的反应时间记为h；加入0.8mL浓度为15％三氯乙酸溶液终止反应；4℃静置30min，5000r/min离心10min收集全部上清液；向上清液中添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值；三个平行吸光度值分别记为y1，y2，y3；y1，y2，y3分别代入方程‑1计算实验组反应体系中与每个平行吸光度值对应的缩二脲的浓度x1，x2，x3；计算平均值4)对照组的测定对照组设3个平行处理；每个平行处理分别取待测粗酶液v，用浓度为0.2mol/L，pH4.5醋酸‑醋酸钠缓冲溶液补足待测粗酶液体积至2mL；50℃水浴预热10min后加入牛血清白蛋白溶液1mL后立即加入0.8mL浓度为15％三氯乙酸溶液，漩涡混合器充分混匀，使蛋白质沉淀，在50℃水浴中的反应时间记为h；5000r/min离心10min收集全部上清液，上清液中添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值，三个平行吸光度值分别记为y01，y02，y03；将对照组的三个吸光度值分别代入方程‑1计算对照组反应体系中与每个平行吸光度值对应的缩二脲的浓度x01，x02，x03，计算平均值5)酶活力计算固体样品内肽酶活力按照如下公式3计算；液体样品内肽酶活力按照如下公式4计算；公式3)、4)中：U：内肽酶活力单位，单位：u实验组缩二脲浓度平均值，单位：mg/mL对照组缩二脲浓度平均值，单位：mg/mL7：单位：mLh：酶与底物反应时间，单位：minm：固体待测样品的取样量，单位：gV：粗酶液提取中定容的体积，单位：mLv：反应组和对照组试管中加入粗酶液体积，单位：mLw：样品水分含量，单位：％V0：液体样品取样的毫升数，单位：mL。