[发明专利]一种基于LAG-3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

摘要

本发明建立了一种基于LAG‑3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白tagRFP偶联于LAG‑3蛋白羧基末端末端(C端)，以及LAG‑3蛋白胞外域(1‑451aa)羧基末端(C端)，分别构建真核表达载体，并制备LAG‑3‑tagRFP及LAG‑3ex‑tagRFP融合蛋白；将人源MHC II蛋白基因构建在CMV启动子下，绿色荧光蛋白EGFP建在人工复合调控元件E‑Box_AP‑1_CRE序列下，并建立新型的稳转细胞系MHC II.E‑Box_AP‑1_CRE‑d2EGFP/A375，以LAG‑3‑tagRFP或LAG‑3ex‑tagRFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗LAG‑3药的效应，可同时获得阻断功能与LAG‑3/MHC II信号通路的生物学效应数据，构建快速筛选抗LAG‑3药物和评估其生物学效应的实验模型。

主权项

1.一种基于LAG‑3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将第一荧光蛋白与LAG‑3蛋白胞外域羧基末端连接，构建重组LAG‑3ex‑第一荧光蛋白融合蛋白；在第一荧光蛋白的C端连接6个组氨酸His标签；2)通过连接肽序列将人源MHC II基因的α亚基与β亚基前后连接在同一个读码框里，并将复合基因亚克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒；在E‑Box_AP‑1_CRE人工复合调控元件下连接第二荧光蛋白，构建调控表达报告基因质粒；将E‑Box_AP‑1_CRE‑第二荧光蛋白和CMV‑MHC II基因共转染到A375黑素瘤细胞，建立稳转细胞系；3)将抗Lag‑3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与重组LAG‑3ex‑第一荧光蛋白融合蛋白共孵育后再与稳转细胞一起共孵育；同时设立稳转细胞与重组LAG‑3ex‑第一荧光蛋白融合蛋白直接共孵育的对照组；4)清洗非特异性结合后，分别检测第一、第二荧光蛋白荧光值，并判断新药对Lag‑3/MHC II信号通路的阻断功能；所述连接肽序列为T2A序列，其蛋白序列为EGRGSLLTCGDVEENPGP。