[发明专利]一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法

摘要

本发明公开了一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，主要包括：基因组DNA提取、抗感品种的PCR片段克隆、抗性基因特异性引物的设计；HRM（高分辨率熔解曲线）反应体系等步骤。最后利用LightCycler®480的Gene Scanning 1.5 version软件进行高分辨率熔解曲线分析。通过该方法能科学高效准确地检测出番茄灰叶斑的抗性基因。

主权项

1.一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行:（1）基因组DNA提取； （2）抗感品种的PCR片段克隆：利用Sm‑Indel‑F /R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA 20‑60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10 µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L ）2.5μL；PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增；循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆；所述的引物指的是：Sm‑Indel‑F:GATCTCATCCCGTTGTATATG ；Sm‑Indel‑R:CACCCACAAACAAATCAAG；（3）抗性基因特异性引物的设计因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计HRM特异性的引物；（4） HRM反应体系PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在荧光定量PCR 仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA 20‑60 ng，premix 10uL,20×Evagreen 1uL，5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL，PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s 进行45 个循环，扩增产物HRM 检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95 ℃的过程中，以25 次 ·‑1 ℃的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃，利用LightCycler®480 的Gene Scanning 1.5 version 软件进行高分辨率熔解曲线分析；所述的引物指的是：Smhrm2F：GATCTCATCCCGTTGTATATGCSmhrm2R GCAAAGACAT GACTAAACTCT。