[发明专利]用于免疫诊断试剂配制的肌钙蛋白I抗体的制备方法及获得的菌株有效
申请号: | 201910015712.3 | 申请日: | 2019-01-08 |
公开(公告)号: | CN109912713B | 公开(公告)日: | 2022-09-13 |
发明(设计)人: | 邹炳德;邹继华;武强;张莉;贾江花;何进军;章玉胜 | 申请(专利权)人: | 美康生物科技股份有限公司 |
主分类号: | C07K16/18 | 分类号: | C07K16/18;G01N33/535;G01N33/577;G01N33/68;C12N1/21 |
代理公司: | 宁波甬致专利代理有限公司 33228 | 代理人: | 沈春红 |
地址: | 315104 浙江省宁*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: |
一种用于免疫诊断试剂配制的肌钙蛋白I抗体的制备方法及获得的菌株,制备步骤包括:(1)设计cTnI蛋白‑NH |
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搜索关键词: | 用于 免疫诊断 试剂 配制 肌钙蛋白 抗体 制备 方法 获得 菌株 | ||
【主权项】:
1.一种用于免疫诊断试剂配制的肌钙蛋白I抗体的制备方法,其特征在于:制备步骤包括:(1)设计cTnI蛋白‑NH2端41~56aa和80~95aa序列短肽作为免疫半抗原;P41~56aa肽段:1.1)肽段‑NH2端半胱氨酸(C)修饰:CXX ISASRKLQLKTLLLQI,XX作为肽段与载体蛋白之间的偶联臂,X为F,G,W,Y,K中的一种氨基酸;1.2)肽段‑COOH端半胱氨酸(C)修饰:ISASRKLQLKTLLLQI XXC,XX作为肽段与载体蛋白之间的偶联臂,X为F,G,W,Y,K中的一种氨基酸;P80~95aa肽段:1.3)肽段‑NH2端半胱氨酸(C)修饰:CXX CQPLELAGLGFAELQD,XX作为肽段与载体蛋白之间的偶联臂,X为F,G,W,Y,K中的一种氨基酸;1.4)肽段‑COOH端半胱氨酸(C)修饰:CQPLELAGLGFAELQD XXC,XX作为肽段与载体蛋白之间的偶联臂,X为F,G,W,Y,K其中一种氨基酸;(2)肽段与载体蛋白偶联2.1)载体蛋白活化:琥珀酰亚胺‑4‑(N‑马来酰亚胺)环已烷‑1‑1羟酸酯作为偶联剂,将SMCC和载体蛋白分别用缓冲液I溶解,然后进行混合进行反应,最后将反应液再透析至缓冲液I中得到活化载体蛋白;2.2)肽段偶联:将肽段用缓冲液II溶解得到肽段溶解液,将肽段溶解液与活化载体蛋白混合反应,最后将反应液透析至缓冲液II;(3)免疫小鼠选用6~8周龄的Balb/c小鼠为免疫对象,分别将偶联P41~56aa和P80~95aa肽段的载体蛋白作为免疫原与福氏(不)完全佐剂按1:1(v/v体积比)比例混合乳化,以适量的免疫剂量按免疫途径进行免疫;(4)细胞融合取Balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞和脾细胞作为滋养层细胞铺于96孔培养板中;选择经免疫后血清效价有意义的免疫小鼠,取冲击免疫后三天的Balb/c鼠脾脏B细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按一定细胞数目比例混合,洗涤离心后,保留细胞沉淀,并在37℃水浴中,逐滴加入适量体积的50%PEG,离心后用HAT培养基重悬,获得杂交瘤细胞;经HAT培养基选择筛选培养后,采用间接ELISA法检测细胞培养上清液,筛选能够分泌目标抗体的阳性细胞株,进行3~5次亚克隆后获得稳定生长的阳性单克隆细胞株;(5)腹水制备及单抗纯化采用体内诱生法制备小鼠腹水:先用致敏剂预刺激Balb/c小鼠,间隔一定时间后,再向小鼠腹腔中注射步骤(4)得到的杂交瘤细胞,7~10天后即采集腹水;从小鼠体内抽取腹水后再通过粗纯和精纯化方法步骤,即获得纯度大于95%的单克隆抗体。
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