[发明专利]一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法

摘要

本发明提供一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，是利用胶囊状培养体系去捕获、扩增非动员的外周血中稀有造血干祖细胞，并制备异质性的造血干祖细胞克隆。本发明通过捕获非动员外周血中的稀有的异质性干细胞，并从形态学上验证了非动员外周血中存在异质性造血干祖细胞。本发明方法具有造血重建、药物开发、移植和免疫治疗、基因编辑的细胞种类等特点。本发明方法为获得病人特异的功能性造血干细胞提供可靠的细胞来源，并积极促进非动员造血干祖细胞在临床上的应用。

主权项

1.一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)起始细胞的来源和准备起始培养的细胞来源使用非动员药物处理的正常外周血，将获得的血液制品，用淋巴细胞分离液或者利用红细胞裂解液去除红细胞，获得的单个核细胞用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液进行洗涤2‑3次，备用；(2)异质性造血干祖细胞克隆的捕获和制备将上述获得的单个核细胞用细胞培养材料水凝胶进行包裹并种植，称之为胶囊状培养体系，用10％蔗糖溶液洗涤一次，20％蔗糖重悬，种植在孔板中，用培养液进行培养，每2‑3天更换培养液，出现不同形态的克隆；(3)单细胞测序技术检测造血干祖细胞克隆的异质性根据形态特征，挑选克隆中的单个细胞，进行单细胞测序，提取单细胞RNA，用带有Oligo的磁珠富集真核生物mRNA，以打断后的mRNA为模板合成cDNA，试剂盒纯化回收，PCR扩增建库，构建好的文库测序，检测单细胞测序转录表达情况，根据基因测序获得的reads数，分析基因表达、基因结构优化、可变剪接、新转录本预测及注释、SNP检测，并从基因表达结果中，筛选出样品间差异表达的基因；(4)异质性造血干祖细胞克隆的表面分子表达胶囊状培养体系中各种克隆长至每个克隆包含30‑80个细胞，将体系打散，混合，用乙二胺四乙酸消化液进行消化，过70um网筛，离心，收获细胞，获得的细胞利用流式细胞仪技术检测造血干祖细胞表面分子表达的情况，包括CD34、CD43、CD45、CD90；(5)体外分化潜能检测对胶囊状培养体系中出现的几种不同形态克隆，根据克隆形状进行挑选，每种克隆挑选200‑300个细胞，于含有生长因子的甲基纤维素半固体培养基进行克隆形成实验，检测不同克隆的多向分化潜能，包括瀑式红系集落，一般小的红系集落，粒系细胞集落，粒系‑巨噬细胞集落，红系‑粒系‑巨噬混合细胞集落；(6)不同克隆的生长潜能检测对胶囊状培养体系中出现的几种细胞类型克隆，包括致密型克隆，血管状克隆，铺路石状克隆，自由分散型克隆，根据克隆形状进行挑选，将不同的克隆单独挑出，于含有造血干祖细胞生长因子的培养基中进行生长潜能研究验，检测不同克隆的自我更新潜能；(7)胶囊状培养体系中造血干细胞转录因子表达的检测胶囊状细胞培养体系整体细胞群体在分子水平的生物学特征研究，利用RNA测序的方式检测胶囊状培养体系中的细胞在转录组水平的变化，特别是造血干细胞相关的转录因子、信号通路和与微环境相关因子；(8)整个胶囊状细胞培养体系整体细胞群体体内造血分化潜能的检测，各种造血集落打散后形成的细胞群体，进行移植实验，检测细胞体内长期自我更新和多向分化潜能，定期检测小鼠体内人源化细胞的植入情况，以同等条件下非胶囊状细胞培养的细胞作为对照。