[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统生产VEGF164转基因细胞系的方法在审
| 申请号： | 201910041468.8 | 申请日： | 2019-01-16 |
| 公开（公告）号： | CN109679923A | 公开（公告）日： | 2019-04-26 |
| 发明（设计）人： | 陈玉林;金妙函;师丙波;蔡蓓;王小龙 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/12;C12N15/85;C12N15/90 |
| 代理公司： | 北京久维律师事务所 11582 | 代理人： | 邢江峰 |
| 地址： | 712000 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统生产VEGF164转基因细胞系的方法，步骤如下：构建针对毛囊特异启动子KAP6.1的3’UTR区的同源打靶载体PB‑G‑H‑VEGF164‑DsRed；设计并合成针对KAP6.1的3’UTR区的CRISPR/Cas9系统切割位点的sgRNA，将合成的sgRNA克隆入pGL3‑U6‑sgRNA‑PGK‑puromycin构成sgRNA转录载体；将同源打靶载体、sgRNA转录载体及Cas9表达载体混合，转染绒山羊胎儿成纤维细胞，经过筛选后获得的阳性绒山羊胎儿成纤维细胞。本发明解决了纯合个体较难获得，基因插入效率较低的问题。 | ||
| 搜索关键词： | 转基因细胞系 成纤维细胞 绒山羊胎儿 打靶载体 系统生产 转录载体 同源 合成 特异启动子 表达载体 基因插入 切割位点 纯合 构建 毛囊 转染 克隆 筛选 | ||
【主权项】：
1.一种利用CRISPR/Cas9系统生产VEGF164转基因细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.构建针对毛囊特异启动子KAP6.1的3’UTR区的同源打靶载体PB‑G‑H‑VEGF164‑DsRed；S2.设计并合成针对KAP6.1的3’UTR区的CRISPR/Cas9系统切割位点的sgRNA，将合成的sgRNA克隆入pGL3‑U6‑sgRNA‑PGK‑puromycin构成sgRNA转录载体；S3.将以上步骤的同源打靶载体、sgRNA转录载体及Cas9表达载体混合，利用![]()
3000转染绒山羊胎儿成纤维细胞，经过筛选后获得的阳性绒山羊胎儿成纤维细胞即为用于生产体细胞核移植的VEGF164转基因细胞系。
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