[发明专利]蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用

摘要

本发明公开了一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用。该方法是利用正向‑反向同位素标记的定量方法结合蛋白热稳定变化测量技术，其能够通过观测细胞内部哪些蛋白在药物的包裹下发生热力学变化，全局性地鉴定与药物相互作用的靶标蛋白。本发明的方法克服了传统鉴定方法的假阳性率高的缺点，其具有高通量、高深度、高精度、检测范围广，耗时短的特点，打破现有技术在药物靶标鉴定方面的局限性，为药物靶标研究提供有力的支撑。

主权项

1.一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)SILAC标记：分别用含有重链同位素和轻链同位素标记的氨基酸的细胞培养液对细胞进行培养，并进行传代，得到重链同位素标记的细胞和轻链同位素标记的细胞；(2)细胞裂解：分别将步骤(1)中重链同位素标记的细胞和轻链同位素标记的细胞进行裂解，得到重链同位素标记的蛋白裂解液和轻链同位素标记的蛋白裂解液；然后将重链同位素标记的蛋白裂解液分成2n份，记为蛋白裂解液A₁、A₂、A₃……A_n，B₁、B₂、B₃……B_n，同时将轻链同位素标记的蛋白裂解液分成2n份，记为蛋白裂解液C₁、C₂、C₃……C_n，D₁、D₂、D₃……D_n；其中，n为正整数，且n≥3；(3)正向‑反向实验：正向实验为将小分子药物分别加入到步骤(2)中获得的蛋白裂解液A₁、A₂、A₃……A_n中，依次得到蛋白裂解液A₁′、A₂′、A₃′……A_n′，同时将药物载体分别加入到蛋白裂解液B₁、B₂、B₃……B_n中，依次得到蛋白裂解液B₁′、B₂′、B₃′……B_n′；反向实验为将小分子药物分别加入到步骤(2)中获得的蛋白裂解液C₁、C₂、C₃……C_n，依次得到蛋白裂解液C₁′、C₂′、C₃′……C_n′，同时将药物载体分别加入到蛋白裂解液D₁、D₂、D₃……D_n中，依次得到蛋白裂解液D₁′、D₂′、D₃′……D_n′；(4)酶解和质谱检测：将步骤(3)中得到的蛋白裂解液A₁′、B₁′和C₁′、D₁′放入温度1中进行处理，将A₂′、B₂′和C₂′、D₂′放入温度2中进行处理，将A₃′、B₃′、C₃′和D₃′放入温度3中进行处理，以此类推，将A_n′、B_n′、C_n′和D_n′放入温度n中进行处理，待处理结束后分别离心，得到蛋白A₁″、A₂″、A₃″……A_n″，B₁″、B₂″、B₃″……B_n″，C₁″、C₂″、C₃″……C_n″，D₁″、D₂″、D₃″……D_n″；然后将蛋白A₁″与B₁″、A₂″与B₂″、A₃″与B₃″……A_n″与B_n″分别进行等体积混合，依次得到混合液E₁、E₂、E₃……E_n，同时，将C₁″与D₁″、C₂″与D₂″、C₃″与D₃″……C_n″与D_n″分别进行等体积混合，依次得到混合液F₁、F₂、F₃……F_n；再向混合液E₁、E₂、E₃……E_n，以及F₁、F₂、F₃……F_n中加入蛋白酶进行消化，得到蛋白消化液E₁′、E₂′、E₃′……E_n′，以及F₁′、F₂′、F₃′……F_n′；最后对其分别进行质谱鉴定，依次得到蛋白定量结果G₁、G₂、G₃……G_n，以及H₁、H₂、H₃……H_n；其中，温度n>温度3>温度2>温度1；(5)结果判断：分别计算蛋白定量结果G₂、G₃……G_n与G₁的比值，得到R₁、R₂……R_n‑1，同时，分别计算蛋白定量结果H₂、H₃……H_n与H₁的比值，得到R₁′、R₂′……R_n‑1′；若R_n‑1……>R₂>R₁>1，且R_n‑1′……R₂′>R₁′>1，则该蛋白为所述小分子药物的靶标蛋白。