[发明专利]一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用，对BCG菌株原生质体和H37Ra菌株原生质体的再生条件进行优化，培养出活性好、生长良好的再生菌株。提供一种制备BCG菌株原生质体和H37Ra菌株原生质体的融合子的方法，其利用电穿孔技术使两种原生质体融合，并探索出其最佳融合条件，同时对融合子进行再生培养，得到生长良好的再生菌株。本发明以BCG和H37Ra两菌株为亲本菌株利用原生质融合技术所成功构建的新型结核病疫苗融合菌株，同时具备卡介苗与H37Ra菌株优良生物特性和遗传性状，探究了此融合菌株的免疫保护效力和安全性，为进一步探讨和研究该融合菌株成为结核病候选疫苗的可能性奠定基础提供依据。

主权项

1.一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、结核杆菌的培养及结核杆菌菌悬液的制备BCG菌株及H37Ra株分别接种于罗氏固体培养基中，每7天观察一次，菌落为淡黄色菌落呈颗粒或菜花样生长；在生物安全柜内，取培养约2～3周罗氏固体培养基上生长状态良好的BCG菌落，置于已高压灭菌的磨菌器中，分别加少量含0.05％Tween‑80的生理盐水至菌株研磨器中，研磨均匀后，使用细菌浊度仪来检测细菌浓度，通过0.05％Tween‑80的生理盐水来调整细菌浓度为1×10⁷/ml；标记，‑20℃冰箱中保存、备用；步骤2、BCG菌株原生质体的制备分别取对数生长期BCG菌液10mL，调整细菌浓度为3.5×107个/mL，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用PBS洗涤两次，加入1ml37℃预热的预处理剂至终浓度为0.01mol/L，37℃水浴保温20min，3500r/min离心5min，再用PBS洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解；水浴作用过程中，每隔一段时间取少量酶处理的BCG菌液加入FDA荧光素染色在荧光显微镜下进行观察原生质体的活性及形成情况；当BCG菌株原生质体的形成率达到90％以上时，离心除酶，再加入原生质体稳定液悬浮原生质体；步骤3、H37Ra菌株原生质体的制备分别取对数生长期H37Ra菌株的菌液10mL，调整细菌浓度为3.5×107个/mL，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用PBS洗涤两次，加入1ml预热的预处理剂至终浓度0.01mol/L，37℃水浴保温20min，3500r/min离心5min，再用PBS洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解；水浴作用过程中，每隔一段时间取少量酶处理的H37Ra菌液加入罗丹明B荧光素染色观察；当H37Ra菌株原生质体的形成率达到90％以上时，离心除酶，再加入原生质体稳定液悬浮原生质体。