[发明专利]一种特异性检测当归ToMV病毒的IC-RT-LAMP检测方法

摘要

本发明公开了一种特异性检测当归ToMV病毒的IC‑RT‑LAMP检测方法，其步骤主要包括用ToMV的抗体IgG特异性捕获ToMV病毒粒子，利用ToMV的特异性引物进行反转录RT反应合成cDNA，再利用特异性的LAMP引物组进行LAMP扩增，反应结束后利用荧光染料肉眼观察法或琼脂糖凝胶电泳检测待检样品是否含有ToMV病毒。本发明特异性强，灵敏度达到了0.45 pg/mL，比普通PCR高100倍，且无需提取RNA，也不需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率、为当归ToMV的检测提供了新的技术平台，可用于监控当归ToMV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

主权项

1.一种特异性检测当归ToMV病毒的IC‑RT‑LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：①免疫捕获IC：1）取100mg感染ToMV的当归组织，加1mL PBS研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000 rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；2）用0.05M，PH9.6的碳酸盐缓冲液将ToMV抗体IgG稀释后混合，使ToMV抗体IgG的终浓度为10μg/mL；取100μL上述稀释的ToMV多克隆抗体 IgG加入0.2mL PCR管中，37℃孵育2h；3）弃去包被液，用PBST洗3次，每次3 min; 加入100μL上述感病组织粗提液，37℃孵育2h；4）弃去感病组织粗提液，用 PBST洗3次，ddH₂O洗1次，短暂离心，吸去残液；②RT反应：1) 在上述免疫捕获PCR管中加入浓度为10 μM的ToMV特异性反向引物ToMV‑R 1μL，DEPC‑H₂O 4μL，混合后于70℃保温10 min，之后迅速冰浴2 min；2）向上述PCR管中加入5×M‑MLV buffer 2μL、10mM dNTPs 1μL、30U/μL RNase抑制剂0.34μL、200U /μL M‑MLV反转录酶0.35μL、DEPC‑H₂O 补足至10μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15 min，得到cDNA第一链用于后续LAMP扩增；③LAMP扩增反应：取一新的PCR管，按以下体系加入各试剂进行LAMP扩增，反应体系为12.5μL，包括50ng cDNA 0.5 μL、10×Thermpopol buffer 1.25μL、100mM MgSO₄ 0.75μL、10mM dNTPs 1.75μL、 10 μM B3 和 F3 Primer 各0.25μL、 10 μM FIP 和 BIP Primer 各2.0μL、8U/μL Bst DNA polymerase 0.5μL、ddH₂O 3.25μL；并以ddH₂O作为阴性对照，以当归ToMV CP基因标准品作为阳性对照；LAMP的反应条件为: 60‑70℃扩增60‑100 min, 随后80℃变性10 min，终止反应；④分析判断反应产物：1）上述步骤③中LAMP反应结束后，在PCR管内侧加 1μL 1000× SYBR Green I荧光染料工作液，盖紧PCR管，上下颠倒混匀，采用肉眼直接观察PCR管内混合液的颜色变化：若混合液颜色变为绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有ToMV；若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含ToMV；2）结果的观察也可以采用琼脂糖凝胶电泳检测技术：取5μL LAMP反应产物进行2.0% 琼脂糖凝胶电泳，在1×TAE缓冲液环境中，100V稳压电泳30min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果：若凝胶中存在明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有ToMV；若凝胶中无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含ToMV。