[发明专利]不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术

摘要

本发明涉及不同类型致泻大肠埃希氏菌检测技术，具体公开了一种不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术。通过一次多管多通路的实时荧光定量PCR检测方法，同时在相同的热循环条件下快速的检测多个基因，实现不同类型致泻大肠埃希氏菌的鉴定，操作更加快捷，易于掌握，可直接通过荧光信号实时观测结果。

主权项

1.不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术，包括如下步骤：1)制备致泻大肠埃希氏菌，作为待检测样品模板；具体方式为使用1μL接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h～24h的菌落，悬浮在200μL 0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于13000r/min离心3min，弃掉上清液；加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为荧光定量PCR检测的模板；所有处理后的DNA模板直接用于荧光定量PCR反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量PCR反应；否则，应在‑20℃以下保存备用(1周内)；2)在包含上下游扩增引物、探针等的反应体系中进行多重荧光定量PCR扩增；每个样品2个荧光定量PCR反应体系，对应检测8个目标基因，2个反应体系的引物如下表：3)扩增过程中，配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，按照反应程序，荧光定量PCR仪自动采集扩增产物的荧光信号；4)结果分析，测定样品基因检测有对应荧光增幅现象，且Ct值小于或等于36，则判定样品含有此荧光信号，根据体系1和体系2中的荧光信号判定致泻大肠埃希氏菌种类。