[发明专利]一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法

摘要

本发明公开了一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法，属于恶性疟原虫青蒿素耐药基因检测技术领域，该方法是基于GeXP系统实现恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的检测；该方法具体包括以下步骤：1)设计引物组该引物组包括一对通用引物和针对恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的四对特异性引物；2)提取恶性疟原虫的DNA；3)建立扩增体系；4)扩增产物分离；5)确定突变基因的类型；上述四对特异性引物在进行PCR扩增实际上是将多对特有异性引物的扩增转化为一对通用引物的扩增，使得各模板的扩增效率趋于一致，而不影响各特有异性引物的扩增效率，从而达到真正的高通量检测鉴别多种病原体的目的。

主权项

1.一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法，其特征在于，该方法是基于GeXP系统实现恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的检测；恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点分别为：Y493H、R539T、I543T以及C580Y；GeXP系统将多重PCR技术和毛细管电泳技术相结合；该方法具体包括以下步骤：1)设计引物组该引物组包括一对通用引物和针对恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的四对特异性引物，四对特异性引物分别为：Y493H特异性引物、R539T特异性引物、I543T特异性引物以及C580Y特异性引物；Y493H特异性引物是在Y493H的末端连接通用引物序列组成；R539T特异性引物是在R539T的末端连接通用引物序列组成；I543T特异性引物是在I543T的末端连接通用引物序列组成；C580Y特异性引物是在C580Y的末端连接通用引物序列组成；2)提取恶性疟原虫的DNA从人体的血液中提取恶性疟原虫的DNA，提取之前需先在人体的血液中加入RNA酶；且检测的人体血液中恶性疟原虫的浓度不低于5×10³copy/μL；3)建立扩增体系将步骤1)所述的四对特异性引物和采用荧光标记的通用引物相结合引发多重体系扩增，具体的为：将步骤1)所述的四对特异性引物、采用荧光标记的通用引物以及步骤2)中所提取的恶性疟原的DNA混合来建立扩增体系；4)扩增产物分离将步骤3)扩增后所得到的产物进行毛细管电泳技术分离，5)确定突变基因的类型将步骤4)中扩增完成后的含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测且计算出扩增片段的大小，将扩增片段的大小与质控品扩增后得到的扩增片段的大小相比较从而确定突变基因的类型。