[发明专利]治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明提供了一种治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体及其制备方法，首先体外表达纯化了人Plk1蛋白，以重组Plk1蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合；通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞；用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得5株治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体。相比现有技术，本发明的制备工艺简单、易行，试剂易得，一次性可提取5株针对癌症治疗靶点：人Plk1蛋白的鼠单克隆抗体，它们通过调控蛋白的活性调控细胞周期；可以通过进一步的抗体人源化改造使其成为具有治疗功能的抗癌药物前体。

主权项

1.治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，利用PCR技术体外扩增Plk1基因，Plk1基因的核酸序列为SEQ ID NO.1所示；S2，Plk1基因的表达和纯化：将Plk1基因连接进入pET‑28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导后收集菌体；高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex‑200柱子进行再次精细纯化，收集Plk1蛋白作为抗原备用，Plk1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；S3，小鼠的免疫：用纯化的Plk1蛋白作为抗原，对6‑8周龄的雌性BALB/c小鼠3只进行三次免疫，每次免疫间隔两周，第三次免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60ug/只，进行加强免疫一次；S4，骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合：分别收集免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞，DMEM培养基洗涤3次后，调整脾细胞数与SP2/0细胞数之比为1∶10，50％PEG1500作用1～2min后，加入含有HAT的完全培养基稀释，接种于96孔培养板，37℃，5％CO₂培养；S5，阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化：经间接ELISA方法连续检测两次都为阳性的细胞孔，按有限稀释法进行亚克隆；如检出细胞孔有特异性抗Plk1蛋白抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的杂交瘤细胞孔，继续同法再克隆至少2次，克隆后阳性孔的杂交瘤细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，可冻存杂交瘤细胞；S6，单克隆抗体的生产：对已经建株的杂交瘤细胞扩大培养同时在BALB/c小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体；S7，单克隆抗体的纯化：腹水用20mM PBS pH7.4稀释3倍以上，离心取上清，经HiTrap protein G亲和层析进行纯化，获得治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体。